胡仁統(tǒng),王俊利,韋葉生,陸 潞,韋貴將,黃 可,廖品琥,唐毓金

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西百色 533000)

·論 著·

廣西壯族人群白細胞介素-27基因rs17855750 G/T、rs40837 A/G多態(tài)性分布特點

胡仁統(tǒng),王俊利,韋葉生,陸 潞,韋貴將,黃 可,廖品琥,唐毓金△

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西百色 533000)

目的 分析廣西壯族人群白細胞介素(IL)-27基因rs17855750 G/T、rs40837 A/G多態(tài)性分布特點，對比其基因型和等位基因頻率與不同國家(地區(qū))間種族的分布差異。方法 采用單堿基延伸的PCR技術對168例廣西壯族人群IL-27 基因rs17855750 G/T、rs40837 A/G進行多態(tài)性檢測，對比國際人類基因組計劃(HapMap)公布的中國北京人、日本人、非洲人和意大利人的單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型數據，分析5個人群rs17855750 G/T、rs40837 A/G位點的基因型和等位基因頻率差異。結果 在廣西壯族人群中IL-27基因rs17855750 G/T位點TT基因型最常見，約為70.2%，T等位基因頻率最高，約為50.3%， rs40837 A/G多態(tài)性位點AA基因型最常見，約為35.7%，A等位基因頻率最高，約為52.1%，IL-27基因rs17855750 G/T、rs40837 A/G多態(tài)性位點基因型及等位基因頻率男女性別間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，IL-27 rs17855750 G/T與北京人比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與日本人、意大利人和非洲人比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；IL-27 rs40837 A/G與北京人比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且與日本人、非洲人和意大利人比較差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論 IL-27基因rs17855750 G/T、IL-27 rs40837 A/G位點基因型和等位基因在廣西壯族人群中的分布頻率與其他國家(地區(qū))人群相比存在差異，這種差異可能是導致某些疾病在不同人群發(fā)病率和臨床表現存在差異的原因之一。

白細胞介素27；多態(tài)性,單核苷酸;分布特點；廣西[壯族自治區(qū)]；種族關系

白細胞介素27(interleukin-27,IL-27)是由Pflanz等在2002年首先發(fā)現，它是一個由IL-27 p28和EBI3亞單位組成的異二聚體細胞因子[1]。IL-27屬于IL-12細胞因子家族,因此與其家族其他成員(IL-12、IL-23、IL-35) 一樣具有很多共同的結構特征和生物學功能，而生物學功能主要是在適應性免疫系統(tǒng)及固有免疫系統(tǒng)中具有調節(jié)作用[2-3]。研究發(fā)現，IL-27基因存在多種功能性多態(tài)性位點，而且這些多態(tài)性位點的遺傳易感性對多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有影響，例如自身免疫性疾病[4]、惡性腫瘤[5]、結核病[6-7]等。因此，深入分析IL-27基因多態(tài)性在不同地區(qū)及不同人群中的分布差異情況，可為探討IL-27基因多態(tài)性及其與某些疾病的發(fā)生、發(fā)展的相關性提供更多強有力的試驗依據，同時能進一步揭示IL-27基因多態(tài)性的生物學功能和遺傳特性。本文采用SNaPshot單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型技術檢測168例廣西壯族人群IL-27基因rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點的遺傳多態(tài)性，并通過NCBI數據庫與北京、日本、意大利和非洲等地區(qū)相應的位點進行比較分析，為探討IL-27相關的遺傳特性在地域及疾病等方面的關聯性提供研究依據。

表1 PCR引物序列及產物長度

1 資料與方法

1.1 一般資料 168份檢測標本來自本院進行體檢的健康人員，標本收集時間大約從2012年10月到2013年10月。作為考察對象各項臨床及實驗室檢查指標均正常，籍貫均為廣西，且長期在廣西居住，向上追溯3代均為壯族人，無可查親緣關系；其中男98例，女70例，年齡18～71歲，平均(39.53±14.39)歲。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 抽取空腹健康體檢者靜脈血2 mL，用含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝劑的血常規(guī)管保存；采用改良碘化鈉法提取白細胞總DNA，DNA保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 PCR 根據NCBI數據庫找到EBI3基因DNA全序列，通過Primer 5引物設計軟件設計引物，再以Blast比對軟件分析得到特異性最好的上、下游引物和延伸引物，見表1，引物擴增區(qū)域必須分別包含rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點的序列。然后進行PCR擴增反應，反應體系為20 μL，cDNA 1.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，Mix-Tag 5.0 μL，ddH2O 12.0 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性15 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共35個循環(huán)；最后1個循環(huán)結束后72 ℃ 10 min延伸以維持擴增DNA雙鏈。最后PCR擴增產物放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SNaPshot SNP分型技術 PCR擴增產物首先用蝦堿酶和外切酶Ⅰ處理純化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit試劑進行延伸反應。延伸產物通過蝦堿酶再次純化，然后采用ABI3130XL測序儀對純化產物進行測序，最后用Gene Mapper 4.0(Applied biosystems)軟件對rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點進行分型分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。根據測序結果直接計算廣西壯族人群rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點基因型和等位基因頻率；登陸NCBI查找國際人類基因組計劃(HapMap)公布的4個國家(地區(qū))人群(北京人、日本人、非洲人和意大利人)基因多態(tài)性位點rs17855750 G/T 、rs40837 A/G的基因型和基因頻率結果。采用χ2檢驗分析廣西壯族人群與HapMap公布的4個國家(地區(qū))人群該位點基因型和等位基因頻率的分布差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結 果

2.1 IL-27基因rs17855750 G/T和rs40837 A/G位點SNP分型結果 IL-27基因rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點的PCR擴增產物片段長度分別為210 bp和217 bp。ABI 3130XL的SNP分型結果顯示，rs17855750 G/T位點的基因型有3種，分別為GG、GT和TT，基因分型結果如圖1；rs40837 A/G位點的基因型有3種，分別為AA、AG和GG，基因分型結果如圖2。

圖1 IL-27基因rs17855750 G/T位點SNP分型結果

圖2 IL-27基因rs40837 A/G位點SNP分型結果

2.2 IL-12基因多態(tài)性在廣西壯族人群中的分布 廣西壯族人群中，IL-27 rs17855750位點的TT基因型最常見，約為70.2%；G等位基因型的頻率略高，約為50.3%。IL-27 rs40837位點的AA基因型最常見，約為35.7%；A等位基因型的頻率較高，約為52.1%。兩位點基因型及等位基因頻率男女組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(rs17855750位點；χ2=0.196,0.105,均P>0.05；rs40837位點χ2=4.123，0010，均P>0.05)。見表3、4。

表3 IL-27基因rs17855750 G/T位點基因型及等位基因頻率在廣西壯族人群的分布[n(%)]

2.3 IL-27基因多態(tài)性與其他國家(地區(qū))人群的比較 廣西壯族人群IL-27 rs17855750 G/T基因型和等位基因頻率與北京人比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與日本、非洲和意大利人差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表5；IL-27 rs40837 A/G基因型與北京人比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，等位基因頻率與北京人比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);L-27 rs40837 A/G基因型和等位基因頻率與日本、意大利和非洲人比較差異仍有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表6。

表4 IL-27基因rs40837 A/G位點基因型及等位基因頻率在廣西壯族人群的分布[n(%)]

表5 不同種族及地區(qū)人群IL-27基因rs17855750 G/T位點多態(tài)性分布頻率的比較[n(%)]

表6 不同種族及地區(qū)人群IL-27基因rs40837 A/G位點多態(tài)性分布頻率的比較[n(%)]

3 討 論

人們對IL-27最開始的認識集中在它具有促炎作用，主要是能夠促進輔助性T淋巴細胞(TH1)反應，因此它被描述成為一種促炎細胞因子[1,8]。但是單獨的IL-27并沒有明顯的直接刺激性，它只有在與IL-12或者IL-2結合的情況下才能誘導NK細胞、T細胞產生促炎物質γ-干擾素(IFN-γ)，并通過IFN-γ發(fā)揮作用[1]。有研究又發(fā)現：IL-27在幼稚CD4+T細胞分化為Th1細胞的過程中起到關鍵性作用，而WSX-1是IL-27的受體，其在Th1分化中的角色已得到證實，通過大鼠動物實驗進行了分析，試驗證明：WSX-1陰性的大鼠產生IFN-γ的水平比野生型大鼠少很多[9-10]。同時發(fā)現WSX-1陰性的大鼠對于胞內寄生病原體L.major具有明顯的易感性，L.major清除依賴Th1介導的反應[9]。然而只有在L.major感染的早期階段IFN-γ的產生才減少,在L.major感染后階段WSX-1陰性的大鼠產生IFN-γ的水平又逐步恢復到與野生大鼠同一水平，因此認為IL-27/WSX-1信號只是在CD4+T細胞分化為Th1的初始階段被需要[11]。而另一項研究又報道：IL-27/WSX-1信號能抑制GATA-3的表達,其中GATA-3是Th2分化過程中一個關鍵性的轉錄因子，因此認為IL-27促進Th1的分化是以一種STAT1-依賴或非依賴方式[12-13]。IL-27不僅具有促炎及抗炎作用，在機體抗結核免疫過程中，IL-27能通過促進單核巨噬細胞產生IFN-γ及增加NK細胞和CD8+T細胞發(fā)揮細胞毒活性作用等方式參與免疫應答[14]。IL-27也能與IL-12協(xié)同作用促進毒性T細胞IL-10的產生[15]。

IL-27在免疫功能方面的作用主要是通過IL-27蛋白來完成，蛋白屬于功能物質，蛋白水平在體內的變化可能影響其發(fā)揮相應的生物學功能，而基因的變化和表現形式往往影響蛋白的合成和分泌。IL-27基因多態(tài)性與疾病發(fā)生、發(fā)展的相關性也得到很多研究者的證實，IL-27基因存在多種功能性多態(tài)性位點，基因多態(tài)性的差異影響體內IL-27的轉錄和表達，可能對一些疾病的發(fā)生和進展產生影響。Zhang等[16]對229例卵巢上皮瘤患者和206例健康人的IL-27基因多態(tài)性檢測發(fā)現，病例組rs153109 C/T位點CC、CT/TT基因型和rs17855750 G/T 位點GG、GT/TT基因型與健康人群組比較差異有統(tǒng)計學意義，且在卵巢上皮瘤患者中IL-27 rs17855750 G/T位點基因型GG和GT要明顯高于對照組，同時還發(fā)現IL-27p28 mRNA在上皮卵巢癌患者中的表達減少，說明IL-27基因多態(tài)性與上皮卵巢癌的易感性相關。Nematollahi等[17]研究發(fā)現IL-27基因rs964位點基因型AA、AG和GG在婦女反復流產組與正常組比較有明顯差異，提示IL-27基因rs964可能是婦女反復流產的一個危險因素。Zhou等[5]在研究基因多態(tài)性與膀胱癌發(fā)病機制時發(fā)現IL-27基因rs153109 C/T位點和rs17855750 G/T位點基因多態(tài)性可能是膀胱癌的易感因素，同時在膀胱癌發(fā)病過程中IL-27在蛋白水平表達也降低。因此，準確分析IL-27基因多態(tài)性在不同人群中的分布，可為深入探討與IL-27相關的各種疾病的發(fā)生、發(fā)展提供更多有力的研究數據。

課題組前期研究也發(fā)現廣西壯族人群IL-12基因rs568408 A/G、rs3212227多態(tài)性分布情況與其他地區(qū)人群比較存在差異[18]。而IL-27作為IL-12家族的重要成員目前有關IL-27基因多態(tài)性在不同地區(qū)不同人群中是否有差異的報道還比較少，為了探討不同地區(qū)不同人群中IL-27基因多態(tài)性的變化情況，本課題組通過試驗及數據庫分析了IL-27基因rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點基因型和等位基因頻率在廣西壯族人群的表現形式及與幾個國家(地區(qū))人群的差異情況。結果顯示，在廣西壯族人群中，rs17855750 G/T和rs40837 A/G 位點基因型和等位基因頻率在男女性別間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明2個位點基因型分布可能與性別無關。而對比HapMap上4個人群的SNP分型數據，廣西壯族人群的rs17855750 G/T位點基因型和等位基因頻率與親緣關系最近的北京人比較差異無統(tǒng)計學意義，但是與親緣關系相對較遠的日本、非洲和意大利等人群相比存在差異。而rs40837 位點基因型和等位基因頻率與以上4個人群比較都存在統(tǒng)計學差異。這表明此2位點基因型分布可能與種族和地域存在密切關系，也符合“親緣關系越近，其基因型分布越相似，親緣關系越遠，差異越顯著”的遺傳學規(guī)律。這說明在種族進化中具有明顯的異質性，而這種遺傳異質性很可能是導致某些疾病在不同地區(qū)不同人群中發(fā)病率和臨床表現存在差異的原因之一。對于rs17855750 G/T位點，廣西壯族人群的基因型及等位基因頻率與北京人比較差異無統(tǒng)計學意義，而rs40837 A/G位點存在差異，這提示rs40837 A/G位點可能是廣西地區(qū)某些特異性疾病發(fā)生、發(fā)展的一個危險因素，這為后續(xù)探討該位點與廣西地區(qū)高發(fā)疾病的相關性提供了有利的線索。

總之，本研究初步探討了廣西壯族人群IL-27基因rs17855750 G/T和rs40837 A/G位點基因多態(tài)性分布情況及其與不同地區(qū)人群的差異，為后續(xù)研究與IL-27相關的疾病提供了參考資料，特別是為探索廣西地區(qū)某些特異性高發(fā)疾病與IL-27基因多態(tài)性的關聯性提供有力的線索和依據，同時也為人類學和群體遺傳學補充了重要數據。

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The distribution characteristics of interleukin-27 gene rs17855750 G/T and rs40837 A/G polymorphism of Zhuang populations in Guangxi*

HuRentong,WangJunli,WeiYesheng,LuLu,WeiGuijiang,HuangKe,LiaoPinhu,TangYujin△

(AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityofNationalities,Baise,Guaqngxi533000,China)

Objective To investigate the distribution characteristics of interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G polymorphism in Zhuang populations of Guangxi,and to compare the distribution differences of genotype and allele frequencies of interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G polymorphisms among different races.Methods The interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G polymorphisms were detected by SNaPshot SNP genotyping technique on 168 persons in Zhuang populations of Guangxi,frequencies of genotype and allele of interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G polymorphisms were analyzed in Zhuang populations,and was compared with the other four populations (HapMap-HCB,HapMap-JPT,HapMap-YRI,HapMap-TSI) from HapMap database.Results The most common genotype and allele of interleukin-27 gene rs17855750 G/T polymorphysms were TT(70.2%) and G(50.3%) in Zhuang populations of Guangxi,and the most common genotype and allele of interleukin-27 gene rs40837 G/T polymorphysms were AC(35.7%) and C(52.1%).There were no significant differences in the genotype and allele frequencies of interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G polymorphysms between male and female gender in Zhuang populations of Guangxi(P>0.05).The frequencies of allele and genotype distribution of IL-27 gene rs17855750 G/T polymorphisms were not significantly different when compared with HapMap-HCB(P>0.05),but were significantly different when compared with HapMap-JPT,HapMap-TSI and HapMap-YRI(P<0.01);The frequencies of allele and genotype distribution of interleukin-27 gene rs40837 A/G polymorphisms were significantly different when compared with HapMap-HCB(P<0.05),and were significantly different when compared with HapMap-JPT,HapMap-YRI and HapMap-TSI(P<0.01).Conclusion There are significant differences in the frequencies of allele and genotype distribution of interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G between Zhuang populations and other ethnic populations,and this variation may lead to a variety of clinical manifestation and morbidity of some diseases.

interleukin-27；polymorphism,single nucleotide;distribution characteristics；Guangxi；race relations

國家自然科學基金資助項目(81260315、81541136)；廣西自然科學基金資助項目(2012GXNSFAA053169)；廣西衛(wèi)生廳自籌經費科研課題項目(Z2014520);百色科技攻關項目(20160610)；廣西高校青年教師基礎能力提升項目(KY2016YB347)。

胡仁統(tǒng)(1988-)，檢驗技師，碩士，主要從事惡性腫瘤的臨床分子診斷研究。

△通信作者:E-mail:tanggujin@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.001

R440

A

1671-8348(2017)23-3169-04

2017-03-14

2017-04-15)