程貝貝，馮 如，陳光俠，費(fèi)素娟

1.徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州221002;2.徐州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科;3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

二甲雙胍對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、凋亡的影響

程貝貝1，馮 如1，陳光俠2，費(fèi)素娟3

1.徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州221002;2.徐州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科;3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

目的 研究二甲雙胍對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，并初步探討其可能的機(jī)制。方法 用不同濃度的二甲雙胍處理人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞48 h后，采用細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑(CCK-8)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡及周期的影響;Western blotting法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)HCT116細(xì)胞中bcl-2、Casepase-3及p53蛋白的影響。結(jié)果分別采用2.5、5、10、20和40 mmol/L二甲雙胍處理HCT116細(xì)胞48 h后，CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，各濃度組均可引起結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用，呈濃度依賴性;流式細(xì)胞儀術(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)藥物處理后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例逐漸增加。另外，腫瘤細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例無明顯改變，S期細(xì)胞的比例減少，但G2/M期細(xì)胞的比例逐漸升高;Western blotting檢測(cè)顯示，二甲雙胍可抑制抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)，激活Casepase-3、p53蛋白表達(dá)。結(jié)論 二甲雙胍可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，G2/M期細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制bcl-2的表達(dá)，活化Casepase-3、p53蛋白表達(dá)有關(guān)。

二甲雙胍;HCCT116;增殖;凋亡;周期

二甲雙胍是一種口服雙胍類降糖藥物，是治療2型糖尿病一線用藥，尤其適用于超重和肥胖的患者，臨床使用已證明了該藥的臨床安全性［1］。近年來，流行病學(xué)研究和病例對(duì)照研究證實(shí)2型糖尿病是腫瘤的危險(xiǎn)致病因素之一［2］。自Evans等［3］首次發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以降低2型糖尿病患者的多種腫瘤的發(fā)病率，隨著腫瘤治療研究的不斷深入，二甲雙胍作為一種常用的降糖藥，其抗腫瘤作用越來越受到關(guān)注。目前有研究［4-7］表明，二甲雙胍可降低乳腺癌、肝癌、皮膚癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤的發(fā)病率及死亡率，但具體產(chǎn)生這一影響的機(jī)制尚不明確。本研究以人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116為模型，采用不同劑量的二甲雙胍處理細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖能力、凋亡及細(xì)胞周期的影響，并初步探索其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購自HyClone公司，二甲雙胍購自Smiga公司，CCK8、細(xì)胞周期及凋亡試劑盒購自南京凱基公司，bcl-2、Casepase-3及p53購自Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HCT116細(xì)胞用含100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，將細(xì)胞置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中，隔天傳代換液，當(dāng)細(xì)胞融合至80%時(shí)用2.5 g/L胰酶消化傳代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。

1.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長期的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞用胰酶消化后，以5×103個(gè)/孔細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合至70%后分別加入二甲基亞砜(DMSO)和不同濃度的二甲雙胍(終濃度分別為 2.5、5、10、20、40 mmol/L)，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，每孔加入100 μl培養(yǎng)基及10 μl CCK-8檢測(cè)試劑，繼續(xù)孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處OD值。設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4 AnnexinV-Fitc/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集處于對(duì)數(shù)生長期的不同處理組細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)整至5×105ml-1并加入結(jié)合緩沖液 Bing buffer 500 μl，先加入5 μl AnnexinV-Fitc，再加入 5 μl碘化丙啶(PI)，室溫避光孵育20 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞周期 二甲雙胍處理48 h后，各組細(xì)胞胰酶常規(guī)消化，PBS洗滌2次，然后加入1 ml 750 g/L的冰乙醇，4℃固定過夜，PBS洗滌3次，棄去上清，加入RNA酶及PI調(diào)整終濃度為50 μg/ml，4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，比較各期細(xì)胞比例。

1.6 Western blotting檢測(cè) 收集不同濃度的二甲雙胍處理后48 h的各組細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，制備濃度為12%的膠，每孔上樣20 μg，恒定電流100 mA電泳1 h后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，37℃脫脂奶粉封閉1 h，加入β-actin、bcl-2、Caspase-3及p53一抗，4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，用相應(yīng)二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，不同處理組間用單因素方差分析進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示，經(jīng)過 2.5、5、10、20、40 mmol/L 二甲雙胍處理48 h后，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖受到明顯的抑制，且呈濃度依賴性，各組抑制率分別為20.8%、27.9%、36.9%、50.9%、68.9%，各濃度組與對(duì)照組比較、各濃度組組間比較，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見圖1)。提示二甲雙胍能抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖。

圖1 二甲雙胍對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effect of metformin on the proliferation of HCT116 cells

2.2 二甲雙胍對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)二甲雙胍作用于HCT116細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，對(duì)照組凋亡率為 (8.15 ±0.91)%;而 2.5、5、10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理后細(xì)胞凋亡率分別為(15.28±0.61)%、(19.15±0.53)%、(25.3±0.51)%、(31.6±0.87)%、(39.23±0.49)%，各濃度組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);二甲雙胍處理組凋亡細(xì)胞比例隨藥物濃度增加而升高，結(jié)果提示，二甲雙胍對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用(見圖2)。

2.3 二甲雙胍對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀觀察二甲雙胍作用于HCT116細(xì)胞48 h對(duì)其細(xì)胞周期分布的影響表明:相較于對(duì)照組，G0/G1期細(xì)胞無明顯改變，S期細(xì)胞的比例減少，G2/M期細(xì)胞的比例增加(P＜0.05)，細(xì)胞周期阻滯，且呈明顯的劑量依賴性(見圖3)。

2.4 二甲雙胍對(duì)HCT116細(xì)胞中bcl-2、Casepase-3、p53表達(dá)的影響 Western blotting結(jié)果顯示:二甲雙胍作用于HCT116細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，抗凋亡蛋白bcl-2相對(duì)表達(dá)量明顯降低，同時(shí)可以激活凋亡相關(guān)蛋白Casepase-3、腫瘤抑制基因p53的表達(dá)，且呈劑量依賴性(見圖4)。

3 討論

結(jié)腸癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均較高，嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康，死亡率僅次于肺癌和肝癌，嚴(yán)重危害人類的健康［8］。盡管目前對(duì)結(jié)腸癌的診治水平有了較大提高，主要包括早期篩查、手術(shù)切除患病部位及化療等方式，但許多患者就醫(yī)時(shí)已錯(cuò)過了手術(shù)治療時(shí)機(jī)，治療效果仍不樂觀。二甲雙胍作為一種口服降糖藥，具有減輕胰島素抵抗、降低血脂等特點(diǎn)。近年來，二甲雙胍還被發(fā)現(xiàn)具有預(yù)防和治療腫瘤的作用。張艷飛等［9］研究顯示，2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者口服二甲雙胍降糖，其腫瘤的預(yù)后恢復(fù)良好。二甲雙胍在結(jié)腸癌治療中的作用機(jī)制尚不明確，盡管已經(jīng)有研究［10-11］表明，二甲雙胍能夠抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但SW480為中分化結(jié)腸癌細(xì)胞株，本研究采用的HCT116為低分化結(jié)腸癌細(xì)胞株，兩個(gè)研究相互補(bǔ)充，共同研究二甲雙胍對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生的影響。

圖2 二甲雙胍對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Effect of metformin on the apoptosis of HCT116 cells

圖3 二甲雙胍對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響Fig 3 Effect of metformin on the cell cycle of HCT116 cells

圖4 二甲雙胍對(duì)bcl-2、Casepase-3、p53的影響Fig 4 Effects of metformin on bcl-2，Casepase-3 and p53

本研究分別觀察了二甲雙胍對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響。目前有許多研究證實(shí)，二甲雙胍對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制作用，本研究中CCK-8法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖影響，結(jié)果顯示，二甲雙胍在體外能夠抑制HCT116細(xì)胞增殖，且隨濃度的增加，該抑制作用更加明顯;細(xì)胞S期細(xì)胞比例不斷減少，G2/M期細(xì)胞比例不斷升高，產(chǎn)生細(xì)胞阻滯。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞過度增殖和凋亡減少有關(guān)。bcl-2家族基因是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)凋亡的重要基因，bcl-2是bcl-2家族中重要分子，主要起抑制細(xì)胞凋亡的作用。Caspase家族是凋亡發(fā)生的執(zhí)行子，凋亡發(fā)生最終引起Caspase活化后一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Caspase-3不僅是細(xì)胞凋亡的下游分子，也是效應(yīng)分子，Caspase-3被激活后，細(xì)胞凋亡基本上是不可避免的［12］。p53基因在防止細(xì)胞過度增殖及保持DNA受損基因組的完整性上都有重要作用，其表達(dá)增加可直接引起細(xì)胞凋亡［13］。研究結(jié)果已顯示:二甲雙胍能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡，為進(jìn)一步分析產(chǎn)生這一作用的具體機(jī)制，我們觀察了二甲雙胍對(duì)HCT116細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理48 h后，bcl-2表達(dá)量降低，細(xì)胞中Caspase-3、p53相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，提示二甲雙胍可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、Caspase-3、p53從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，且這種作用可能呈濃度依賴性。

結(jié)合上述研究結(jié)果顯示，二甲雙胍在體外能有效抑制HCT116細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生G2/M期細(xì)胞阻滯，其機(jī)制可能是通過抑制抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)，同時(shí)激活p53/Caspase-3信號(hào)通路、促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，為二甲雙胍作為結(jié)腸癌治療藥物提供了新的依據(jù)。

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聲 明

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《胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志》編輯部

The effects of metformin on proliferation and apoptosis in colon cancer HCT116 cells

CHENG Beibei1，F(xiàn)ENG Ru1，CHEN Guangxia2，F(xiàn)EI Sujuan3
1.Xuzhou Medical University，Xuzhou 221002;2.Department of Gastroenterology，the First People’s Hospital of Xuzhou;3.Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University，China

ObjectiveTo observe the effects of metformin on proliferation and apoptosis in colon cancer HCT116 cells and investigate its possible mechanism.MethodsTreated with different concentrations of metformin in colon cancer HCT116 cells after 48 hours，the proliferation of HCT116 cells was assessed by CCK-8 assay，the cell apoptosis and cycle changes were analyzed by flow cytometry.The expressions of bcl-2，Casepase-3 and p53 in the treated HCT116 cells were detected by Western blotting.ResultsTreated with 2.5，5，10，20 and 40 mmol/L of metformin in HCT116 cells after 48 hours，CCK-8 assay showed that the different concentrations of metformin decreased the proliferation of HCT116 cells in a dose-dependent manner.Flow cytometry results demonstrated that，compared with the control group，after treated with metformin，the apoptosis of cells increased gradually.In addition，tumor cells at G0/G1phase had no obvious change，S phase cells decreased，but G2/M phase cells increased gradually;Western blotting showed that metformin could inhibited antiapoptotic proteins expression of bcl-2，meanwhile activated Casepase-3，p53 protein expression.ConclusionMetformin can inhibit proliferation of colon cancer cell，block the cell cycle at G2/M phase，induce apoptosis mainly by down-regulating the expression of bcl-2，activating Casepase-3，p53 protein expression.

Metfomlin;HCT116;Proliferation;Apoptosis;Cell cycle

R735.3+5

A

1006-5709(2017)08-0857-04

2017-02-09

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.005

費(fèi)素娟，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:消化道腫瘤的臨床與基礎(chǔ)。E-mail:xyfyfeisj99@163.com