張 軍，安 萍，沈 磊，黃 旭，李 明，于紅剛

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢430060

STAT3/AKT信號(hào)通路在結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29順鉑耐藥中的作用

張 軍，安 萍，沈 磊，黃 旭，李 明，于紅剛

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢430060

目的 探討STAT3/AKT信號(hào)通路在結(jié)腸癌細(xì)胞中對(duì)順鉑化療敏感的影響。方法 以結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29為研究對(duì)象，應(yīng)用化療藥物順鉑并設(shè)定一系列梯度濃度及不同的時(shí)間點(diǎn)處理對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，利用Real-Time PCR檢測(cè)AKT的表達(dá)。應(yīng)用順鉑和活性氧抑制劑NAC單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用處理HT-29細(xì)胞后測(cè)定細(xì)胞中活性氧水平及STAT3、AKT及磷酸化磷酸化STAT3的表達(dá)水平，應(yīng)用STAT3抑制劑處理結(jié)腸癌細(xì)胞后檢測(cè)AKT的表達(dá)。結(jié)果 應(yīng)用順鉑處理結(jié)腸癌細(xì)胞后，活性氧產(chǎn)生增加;AKT在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與順鉑呈濃度依賴(lài)性，其在4 h時(shí)表達(dá)水平最高;單用順鉑組中STAT3及AKT的活性高于聯(lián)合用藥組;應(yīng)用STAT3抑制劑后AKT的表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 應(yīng)用活性氧抑制劑通過(guò)阻斷STAT3/AKT信號(hào)途徑提高結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性。

順鉑;結(jié)腸癌;活性氧;STAT3;AKT

我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率與病死率都非常高，雖然臨床治療腫瘤的方法不斷更新，但順鉑等化療藥物仍是目前較為常用的藥物，但因其耐藥性等不良反應(yīng)而限制其臨床進(jìn)一步廣泛應(yīng)用［1］。本課題組前期研究［2］提示，順鉑等化療藥物可以導(dǎo)致AKT表達(dá)水平的增加，提示其耐藥性的產(chǎn)生可能與此有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以結(jié)腸癌細(xì)胞HT29為研究對(duì)象，初步探討順鉑聯(lián)合活性氧抑制劑NAC對(duì)降低結(jié)腸癌順鉑耐藥性影響。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)腸癌細(xì)胞HT29購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)，AKT抗體、STAT3抗體及p-STAT3抗體均購(gòu)自CST公司，順鉑及WP1066購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 HT29細(xì)胞在含100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中孵育。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分4組:順鉑組、NAC組、順鉑+NAC組和空白對(duì)照組。

1.3 活性氧的測(cè)定 常規(guī)6孔板培養(yǎng)細(xì)胞分別為空白對(duì)照組及單用順鉑組，順鉑藥物濃度為100 μmol/L，4 h后用PBS沖洗6孔板，并加入濃度為33 g/L DCFDA孵育30 min后用PBS沖洗2遍，用流式細(xì)胞儀及顯微鏡觀察測(cè)定活性氧。

1.4 Real Time-PCR檢測(cè)AKT在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá) 細(xì)胞總RNA采用LifetechnoIogies公司TrizoIRe-agent抽取，逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒購(gòu)自LifetechnoIogies公司，PCR擴(kuò)增引物由Invitrogen公司合成，AKT上游引物:5'-TCTATGGCGCTGAGATTGTG-3'，下游引物:5'-CTTAATGTGCCCGTCCTTGT-3'。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)STAT3、AKT及磷酸化STAT3 按照預(yù)設(shè)實(shí)驗(yàn)組，順鉑及NAC分別作用4 h后提取各組總蛋白。另設(shè)定順鉑濃度為100 μmol/L及WP1066(STAT3抑制劑)5 μmol/L作用24 h。計(jì)算20 mg體積下的上樣量，蛋白電泳，纖維膜電轉(zhuǎn)后將膜用50 g/L干燥脫脂奶粉的Tris緩沖液含1 g/L吐溫20，加入預(yù)設(shè)的抗體孵育過(guò)夜，加入抗兔及抗鼠的二抗增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光以便檢測(cè)，X線膠片顯影等。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活性氧的測(cè)定 單用順鉑作用后，其活性氧的水平明顯高于空白對(duì)照組(見(jiàn)圖1)。

2.2 Realtime PCR測(cè)定順鉑在不同濃度及時(shí)間點(diǎn)AKT的表達(dá) AKT轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與順鉑呈濃度依賴(lài)性，其在4 h時(shí)AKT表達(dá)水平最高(見(jiàn)圖2)。

2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡測(cè)定STAT3、AKT及磷酸化STAT3的表達(dá) 單用順鉑組中STAT3及AKT的活性高于聯(lián)合用藥組，應(yīng)用STAT3抑制劑后AKT的表達(dá)下調(diào)(見(jiàn)圖3～4)。

圖1 單用順鉑及空白對(duì)照作用細(xì)胞內(nèi)活性氧水平Fig 1 The level of ROS in human colon cancer cell line

圖2 各處理組AKT在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá) A:不同濃度的順鉑;B:順鉑濃度為100 μmol/L時(shí)不同的作用時(shí)間Fig 2 The levels of AKT expression at a transcriptional level A:different concentrations of cisplatin;B:different time points by cisplatin concentration 100 μmol/L

圖3 不同處理因素HT29細(xì)胞中STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的變化;圖4 STAT3抑制劑處理HT29細(xì)胞后AKT的表達(dá)變化Fig 3 The expressions of STAT3 and p-STAT3 in human colon cancer cell line;Fig 4 The expression of AKT after treated with STAT3 inhibitor

3 討論

近年來(lái)，治療腫瘤的新方法不斷涌現(xiàn)，但化療藥物仍是目前的主要手段［3］。盡管其治療效果較為明顯，但因其較易產(chǎn)生耐藥性而限制其廣泛應(yīng)用。如何減少腫瘤藥物的耐藥性成為近年來(lái)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

活性氧包括氧離子、過(guò)氧化物和含氧自由基等［4］。有研究［5］顯示，活性氧水平過(guò)高則會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成損壞。另有研究［6］表明，腫瘤細(xì)胞活性氧的表達(dá)水平增高，而活性氧在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用順鉑處理結(jié)腸癌細(xì)胞后活性氧的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組，提示順鉑可能通過(guò)活性氧來(lái)調(diào)控信號(hào)通路的傳導(dǎo)來(lái)發(fā)揮作用。

近年來(lái)，有研究［7］表明，PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑不僅在腫瘤發(fā)展中起重要作用，而且在腫瘤治療的潛在反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。磷脂酰肌醇3-激酶由催化(CAT)亞基和銜接子/調(diào)節(jié)亞基組成的異二聚體，分為兩類(lèi):具有蛋白酪氨酸激酶活性的受體活化的亞類(lèi)IA(PI3Kα、β和δ)和與G蛋白偶聯(lián)的受體活化的亞類(lèi)IB(PI3Kγ)。AKT激酶屬于AGC激酶家族，與AMP/GMP激酶和蛋白激酶C相關(guān)。由三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域組成:N末端PH結(jié)構(gòu)域、中心激酶CAT結(jié)構(gòu)域和含有C末端延伸(EXT)的調(diào)節(jié)性疏水結(jié)構(gòu)域［8］。近來(lái)有研究［9］表明，許多腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥性的產(chǎn)生與PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活有關(guān)。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路參與胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥性的形成與AKT的活化有一定的關(guān)系，在應(yīng)用順鉑等化療藥物處理胃癌細(xì)胞后AKT的表達(dá)增強(qiáng)，提示AKT的表達(dá)水平與化療藥物的耐藥性形成有一定的關(guān)系［10］。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用順鉑處理結(jié)腸癌細(xì)胞后AKT的表達(dá)與順鉑濃度呈正相關(guān)，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道相符。STAT3是STAT蛋白家族的成員，STAT3被受體相關(guān)的Janus激酶(JAK)磷酸化，形成同源或異源二聚體，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用［11-12］。實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合應(yīng)用順鉑和活性氧抑制劑處理結(jié)腸癌細(xì)胞STAT3的蛋白表達(dá)水平與單用順鉑或活性氧抑制劑表達(dá)下調(diào)，而應(yīng)用STAT3抑制劑處理結(jié)腸癌細(xì)胞后AKT的蛋白表達(dá)水平下調(diào)。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，腫瘤化療藥物耐藥性可能通過(guò)STAT3/AKT信號(hào)通路進(jìn)行傳導(dǎo)。而應(yīng)用活性氧抑制劑可降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，從而拮抗該信號(hào)通路，提高化療藥物的敏感性，但是其具體機(jī)制仍不明確，還需進(jìn)一步研究。

對(duì)于臨床中常見(jiàn)的化療藥物耐藥性問(wèn)題，目前主要的應(yīng)對(duì)方案是采取聯(lián)合用藥，但隨著藥物種類(lèi)及劑量增加，藥物的不良作用也會(huì)增加。因此，在腫瘤患者接受化療治療前能針對(duì)性小劑量用藥，那么患者的依從性將大大提高。本研究表明，活性氧抑制劑NAC主要是通過(guò)降低細(xì)胞信號(hào)通路中的STAT3/AKT表達(dá)水平來(lái)提高順鉑治療的敏感性。所以，活性氧抑制劑和傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用在腫瘤的治療方面具有潛在的臨床價(jià)值，但其具體的分子生物學(xué)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯:王全楚)

Effect of STAT3/AKT signal pathway in resistance of colon cancer cells to cisplatin

ZHANG Jun，AN Ping，SHEN Lei，HUANG Xu，LI Ming，YU Honggang
Department of Gastroenterology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China

ObjectiveTo investigate the effect of STAT3/AKT signal pathway in resistance of colon cancer cells to cisplatin and to explore possible mechanisms.MethodsThe colon cancer cell HT-29 was treated with different cisplatin concentrations and time points;the expression of AKT was detected by Real-Time PCR.Cisplatin alone or combination with NAC was used to treat HT29 cells，after treatment，the level of ROS was measured by microscope and flow cytometry.Expressions of AKT，STAT3 and p-STAT3 were detected by Western blotting.The HT29 cells were treated with STAT3 inhibitor and then the expression of AKT was measured by Western blotting.ResultsThe level of ROS was higher in the cisplatin group.The expression of AKT in the cisplatin group depended on its concentration and was highest at the 4th hour，while the expression of STAT3 was significantly lower in the combination group than that in the cisplatin group.The expression of AKT was down-regulated after STAT3 inhibitor.ConclusionThe ROS inhibitor NAC could block the STAT3/AKT signaling pathways and increase the sensitivity of colon cancer cells to cisplatin.

Cisplatin;Colon cancer;ROS;STAT3;AKT

R735.3+5

A

1006-5709(2017)08-0849-03

2017-03-07

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.003

張軍，博士，研究方向:消化道腫瘤防治。E-mail:zhangjun0532027@126.com

于紅剛，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向:消化道腫瘤的發(fā)病機(jī)制與防治、消化道內(nèi)鏡治療。E-mail:honggangyuwhu@163.com