李 淼，李春玲，宋 帥，楊冬霞，蔡汝健，李 艷，蔣智勇，勾紅潮，楚品品

(1.廣東省農業(yè)科學院 動物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；3.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東 廣州 510640)

豬鏈球菌ssnA基因缺失突變菌株的構建及毒力分析

李 淼1,2,3，李春玲1,2,3，宋 帥1,2,3，楊冬霞1,2,3，蔡汝健1,2,3，李 艷1,2,3，蔣智勇1,2,3，勾紅潮1,2,3，楚品品1,2,3

(1.廣東省農業(yè)科學院 動物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；3.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東 廣州 510640)

分泌型核酸酶基因ssnA是近年來研究發(fā)現的一種脫氧核糖核酸酶，被認為是一種豬鏈球菌2型(SS2)潛在的毒力因子。為了分析ssnA基因對于SS2毒力的影響，通過體外構建具有同源臂的重組自殺性質粒，電轉化進入 SS2，經同源重組構建了SS2流行毒力株GD01的ssnA基因缺失突變菌株，并通過比較分析了野生菌株與缺失突變菌株的生長特性及溶血活性等生物學特性。結果顯示，GD01株與ΔssnA突變株的生長速度及溶血活性沒有明顯差異；ssnA基因缺失后SS2對Hep-2細胞的黏附及入侵能力則明顯下降。小鼠毒力試驗結果顯示，ssnA基因缺失突變菌株對于CD1小鼠LD50是6.17×108cfu，而SS2野生菌株的LD50是4.42×107cfu，缺失突變株的LD50約是野生株的14倍，表明ssnA的缺失對SS2毒力產生明顯影響，提示ssnA基因在其致病過程中具有重要作用，其具體作用機制需進一步分析。

豬鏈球菌2型；ssnA基因；基因缺失；毒力

豬鏈球菌(Streptococcussuis，S.suis)是當前嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種最重要的病原菌，能夠引起豬關節(jié)炎、腦膜炎、肺炎、心內膜炎、敗血癥甚至急性死亡[1-3]。根據豬鏈球菌表面多糖抗原分型，其目前主要分為35個血清型[4]。其中豬鏈球菌2型 (SS2) 分布最廣，分離率最高，致病性最強，同時也是一種重要的人獸共患病原菌[5-6]。1968 年丹麥首次報道了人感染豬鏈球菌的病例，隨后在英國、美國、巴西、澳大利亞、西班牙及新西蘭等國均有過人感染豬鏈球菌的報道[7-9]。1998年和2005年在中國江蘇和四川分別發(fā)生了較大規(guī)模的人感染豬鏈球菌疫情，累計報告發(fā)病229 例，死亡52例，對公共衛(wèi)生安全造成了嚴重影響[10]。最近研究證實，多種血清型的豬鏈球菌均能感染人類[11]。

目前，國內外缺乏對豬鏈球菌毒力因子和致病機制的全面了解，已確認與豬鏈球菌的致病性相關的毒力因子包括莢膜多糖(CPS)、溶血素(SLY)、胞外因子(EF)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、精氨酸氨基肽酶(ADIs)及纖連蛋白結合蛋白(FBPS)等[12-17]。但由于毒力因子的多樣性以及復雜性，單靠現有的毒力因子還不足以全面解釋SS2的致病機理。

分泌型核酸酶因其具有脫氧核糖核酸酶活性而能夠直接作用于細胞中關鍵的大分子物質DNA，因此推測其是潛在的毒力因子。Fontaine 等[18]在 SS2 致病菌株 SX332 和后來的 1～9 型菌株中，發(fā)現了一種分泌型核酸酶SsnA。反轉錄 PCR 表明ssnA在豬鏈球菌整個生長過程中均表達。該研究分析分離于豬上頜棉拭子或鼻拭子以及豬內部器官的豬鏈球菌發(fā)現，ssnA的表型與其分離位置密切相關，提示ssnA是一種新型的毒力因子。最新的研究已經證實，ssnA是SS9的一個毒力因子[19]。本研究利用同源重組技術構建了SS2強毒株ssnA基因的缺失突變菌株ΔssnA，比較了野生菌株與ΔssnA的生長特性及對宿主細胞的黏附與入侵，進一步分析了ssnA基因缺失對豬鏈球菌毒力的影響，為研究該基因的功能以及其在豬鏈球菌致病過程中的作用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株、質粒及生化試劑

大腸桿菌DH5α、BL21由廣東省農業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所豬病實驗室保存；SS2菌株GD01由本實驗室從發(fā)病豬體內分離、鑒定并保存；溫敏型自殺質粒pSET4s由Takamatsu[20]博士惠贈；T4DNA連接酶、DNA限制性內切酶及pMD19-T載體購于寶生物工程(大連) 有限公司；壯觀霉素(Spc)及氯霉素(Cm)購自 Sigma 公司。

1.2 細胞系及試驗動物

人喉上皮癌細胞系Hep-2由本實驗室保存，6周齡雌性CD1小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.3 引物

本研究所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成(表1)，下劃線部分為酶切位點。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.4 基因缺失突變株的構建及鑒定

以 SS2 分離株GD01基因組DNA為模板，分別擴增ssnA基因上游序列P1和下游序列P2；以穿梭質粒 pSET3 為模板，擴增 CmR基因盒序列，將得到的3個片段的基因序列分別連接到 pMD19-T 載體上，經測序鑒定正確后酶切回收目的基因片段并定向以P1-Cm-P2的順序連接到溫敏型自殺性載體質粒 pSET4S 中，得到自殺性質粒 pSET4SΔssnA；將其轉入 GD01 菌株中，篩選具有 CmR的克隆，利用 PCR 鑒定和測序證實獲得ssnA基因缺失突變株 ΔssnA。

1.5 基因缺失突變株 ΔssnA的生物活性測定

將ssnA基因缺失突變菌株ΔssnA和野生菌株GD01分別接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至平臺期，將2種菌株分別在血平板上劃線，在37 ℃、5% CO2孵箱內培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血環(huán)大小。測定平臺期2個菌株的OD600，用TSB培養(yǎng)基稀釋至OD600=0.2后，按1%比例轉接，連續(xù)培養(yǎng)12 h，每隔1 h 測OD600，繪制生長曲線。

1.6 基因缺失突變株對Hep-2細胞的黏附和入侵

將基因缺失菌株 ΔssnA和野生菌株GD01培養(yǎng)至對數生長期，用1640培養(yǎng)基稀釋至5×106～1×107cfu/mL。將Hep-2細胞在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至單層后加入適當稀釋的菌液，于37 ℃、5%CO2條件下孵育。感染2 h后，用無菌PBS(pH值7.4)洗滌3次。然后每孔加入200 μL細胞洗脫液(含0.1% EDTA和0.25%胰蛋白酶的PBS)。洗脫后，每孔加入800 μL PBS(含0.025%Triton X-100)對細胞進行破碎。將上述溶液倍比稀釋涂布于TSA平板，37 ℃培養(yǎng)過夜后統(tǒng)計菌落數量。

細胞入侵試驗是在上述試驗結束后，每孔加入1 mL細胞培養(yǎng)液(含5 μg青霉素和100 μg鏈霉素)，于37 ℃、5%CO2條件下孵育1 h。

1.7 基因缺失突變株ΔssnA對小鼠致病力分析

選取6周齡CD1雌性遠交系小鼠，用于小鼠半數致死量(LD50)測定試驗。將野生菌GD01和缺失菌ΔssnA培養(yǎng)至對數生長期后進行細菌計數。按照預試驗得出的最高、最低劑量對數差，分成幾個對數等距的劑量組。以腹腔接種的方式注射CD1小鼠，每天觀察小鼠的臨床癥狀和死亡情況，觀察期為14 d。最后通過PCR 對死亡小鼠和正常處死小鼠的肝臟、腎臟和脾臟等器官分離的細菌進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 GD01株ssnA基因缺失菌株ΔssnA的構建及鑒定

根據GenBank中登錄的SC84菌株全基因序列(序列號為NC_012924)，設計擴增出ssnA基因上游序列P1(865 bp) 和下游序列P2(624 bp)；根據GenBank登陸的穿梭質粒pSET3序列(No.AB042431)設計擴增出Cm基因(1 056 bp)，結果如圖1所示；將酶切后的目的片段和pSET4S載體連接轉化后，構建得到自殺性載體質粒pSET4SΔssnA。將 pSET4SΔssnA質粒加入新鮮制備的GD01野生菌株電轉感受態(tài)細胞中進行電擊轉化后，利用4對PCR引物鑒定及測序證實ssnA基因被Cm抗性基因盒所替代，如圖2所示，SS 16S rRNA陽性，成功缺失ssnA基因的突變株 CmR陽性，SpcR陰性，ssnA基因敲除鑒定引物陽性，PCR 擴增結果如上述預期，說明成功獲得 SS2ssnA基因缺失突變菌株。

2.2 缺失菌株ΔssnA的生長特性

觀察發(fā)現野生株及缺失株的菌落形態(tài)和溶血環(huán)大小無明顯區(qū)別。如圖3所示，缺失菌株 ΔssnA與野生型菌株的生長特性相似。

2.3 細胞黏附及入侵試驗

本試驗以Hep-2細胞為模型，比較了野生菌株與基因缺失菌株ΔssnA黏附及入侵的能力。如圖4所示，ssnA基因缺失菌株ΔssnA的黏附和入侵能力極顯著低于野生菌株GD01，提示ssnA基因可能與豬鏈球菌的致病性相關。

M.DL2000 DNA Marker；1.ssnA上游序列；2.ssnA下游序列；3.Cm序列。M.DL2000 DNA Marker； 1.The upstream sequence of ssnA； 2.The downstream sequence of ssnA； 3.Cm fragment.

A.16S rRNA片段(294 bp)；B.Cm基因片段(1 056 bp)；C.P3-F/P3-R擴增片段；M1.DL600 DNA Marker； M2.DL2000 DNA Marker； 1，3，5.野生型菌株；2，4，6.ssnA缺失突變菌株。A.16S rRNA(294 bp)； B.Cm fragment (1 056 bp)；C.P3-F/P3-R fragment；M1.DL600 DNA Marker； M2.DL2000 DNA Marker； 1，3，5.Wild-type strain；2，4，6.Mutant strain ΔssnA.

圖3 野生菌株與缺失突變菌株生長曲線的比較Fig.3 Growth curve of wild-type and mutant strains

2.4 小鼠致病力分析

選取CD1小鼠為動物模型，用不同濃度的野生菌GD01和ssnA基因缺失菌株對其進行攻毒，觀察記錄小鼠的存活情況 (表2)。結果表明，ΔssnA菌株的LD50(6.17×108) 約為野生菌株 ΔssnA的 LD50(4.42×107) 的14倍，表明ssnA基因缺失后，SS2毒力明顯下降。

表2 野生株GD01和基因缺失突變株ΔssnA對小鼠的LD50結果Tab.2 The LD50 of the GD01 and ΔssnA strains in CD1 mice

**.P<0.01。

3 討論

近年來新發(fā)現的一些酶類，如三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和谷氨酸脫氫酶(GDH)能嚴重影響 SS2 的致病力[21-22]。GAPDH是一種參與糖分解途徑的酶，其作為毒力因子可通過與肌球蛋白、纖連素、肌動蛋白和血纖蛋白溶酶等不同的宿主蛋白結合而發(fā)揮作用。豬鏈球菌GDH在細胞表面表達，是NADP(H)特異性酶，GDH有保守的抗原性，能與豬鏈球菌的陽性豬血清反應，因此，可作為檢測豬鏈球菌的重要標志性抗原。分泌型核酸酶基因ssnA作為豬鏈球菌的潛在毒力因子，最早是由Fontaine等[18]發(fā)現的。隨后，張東[23]研究了ssnA的部分生物學特性，建立了能特異性檢測豬鏈球菌ssnA基因的PCR檢測方法，并用甲苯胺藍法檢測驗證了其核酸酶的活性。近年來，De Buhr等[24]通過體外試驗證實了ssnA 能夠有效降解中性粒細胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps，NETs)，但并未通過動物試驗證實其對細菌毒力的影響。目前為止，仍然缺乏針對ssnA基因在豬鏈球菌致病過程中作用的具體研究。因此，本研究以豬鏈球菌中分泌型核酸酶基因ssnA作為研究對象，構建了ssnA基因缺失突變株ΔssnA，并在此基礎上分析了ssnA的缺失對SS2基本生物學性狀以及致病力的影響，為探明豬鏈球菌潛在的毒力因子及其致病機理奠定了基礎。

為了構建ssnA基因缺失突變株，利用穿梭載體pSET4S攜帶ssnA基因的側翼序列，通過經典的同源重組技術將SS2流行強毒株中的ssnA從基因組中敲除。pSET4S是一種溫敏型自殺性載體質粒，當溫度為28 ℃時可以在豬鏈球菌中正常復制，而質粒上的溫敏復制子在溫度達到37 ℃時失去作用，從而實現質粒自殺。由于影響基因缺失菌株構建的因素很多[25-26]，且通常在整個過程中只有極少的細菌發(fā)生了重組，因此需要進一步通過抗性篩選、PCR鑒定等進行驗證。本研究利用經典的基因重組技術成功構建了ssnA基因缺失突變株ΔssnA，為研究ssnA基因的功能提供了保障。

本研究針對分泌型核酸酶SsnA對SS2致病力的影響進行了分析，體外生長特性試驗結果顯示，基因缺失突變株與野生株的生長速率及溶血活性沒有明顯差異。細胞感染結果顯示，ΔssnA菌株對Hep-2細胞的黏附及入侵能力均明顯降低。由于豬鏈球菌入侵宿主時，先是黏附于表面上皮細胞，進一步突破上呼吸道屏障后通過血液循環(huán)系統(tǒng)到達全身各處，并最終引起機體感染。因此，揭示ssnA可能在豬鏈球菌的感染過程中也發(fā)揮了一定的作用。CD1小鼠的體內動物試驗分析進一步證實，ssnA基因敲除后，豬鏈球菌毒力下降明顯，表明ssnA是SS2的毒力因子，但其具體作用機制尚需進一步的研究。

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Construction and Virulence Analysis of thessnAGene Knock-out Mutant ofStreptococcussuisSerotype 2

LI Miao1,2,3，LI Chunling1,2,3，SONG Shuai1,2,3，YANG Dongxia1,2,3，CAI Rujian1,2,3，LI Yan1,2,3，JIANG Zhiyong1,2,3，GOU Hongchao1,2,3，CHU Pinpin1,2,3

(1.Institute of Animal Health，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China；2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention，Guangzhou 510640，China；3.Guangdong Open Laboratory of Veterinary Public Health，Guangzhou 510640，China)

Streptococcussuisnuclease A (ssnA) is a recently discovered deoxyribonuclease (DNase)，which is one of potential virulence factors ofStreptococcussuisserotype 2(SS2).To determine the effects ofssnAon virulence，thessnAdeletion mutant (ΔssnA) was constructed by using the suicide vector pSET4S.The growth and hemolytic activity of thessnAgene mutant strain had no obvious difference compared with the wild-type strain.The ability of ΔssnAmutant to interact with human laryngeal epithelial cell (Hep-2) was evaluated and it exhibited dramatically decreased ability to adhere to and invade Hep-2 cells.For CD1 mice，the LD50of the mutation strain was 6.17×108cfu，whereas the LD50of wild-type strain was 4.42×107cfu.This mutation was found to exhibit significant attenuation of virulence when evaluated in CD1 mice，suggestingssnAplays a critical role in the pathogenesis of SS2，the mechanism of this protein is valuable for further analysis.

Streptococcussuis2；ssnA； Gene mutant； Virulence

2017-04-22

廣州市科技計劃項目(201510010142)；廣東省科技計劃項目(2016B020202004)；廣東省公益研究與能力建設專項資金(2014B070706011)；廣東省國際合作項目(2015B050501007)

李 淼(1982-)，女，黑龍江哈爾濱人，副研究員,博士，主要從事細菌分子生物學研究。

李春玲(1965-)，女，河南長葛人，研究員，博士，主要從事獸醫(yī)微生物學研究。

Q78； S828

A

1000-7091(2017)04-0001-06

10.7668/hbnxb.2017.04.001