趙永長，宋文靜，董建新*，邱春麗，況 帥，管恩娜，禚其翠，劉冬梅

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草生物學與加工重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院青島煙草資源與環(huán)境野外科學觀測試驗站，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081；3.云南省煙草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655000）

黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗活性氧代謝的影響

趙永長1,2，宋文靜1，董建新1*，邱春麗3，況 帥1，管恩娜1,2，禚其翠1,2，劉冬梅3

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草生物學與加工重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院青島煙草資源與環(huán)境野外科學觀測試驗站，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081；3.云南省煙草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655000）

為揭示黃腐酸鉀提高烤煙抗旱能力與體內(nèi)活性氧代謝之間的關系，以不同抗旱能力的烤煙品種紅花大金元和云煙100為試驗材料，采用控制水培試驗，研究了葉面噴施黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片中活性氧自由基（ROS）、抗氧化酶活性、抗氧化物質和丙二醛（MDA）含量的影響。結果表明，干旱脅迫處理提高了烤煙幼苗葉片內(nèi)超氧陰離子（O2?）產(chǎn)生速率、過氧化氫（H2O2）和MDA含量，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性都有不同程度升高，谷胱甘肽（GSH）含量在脅迫前期也明顯升高，而抗壞血酸（AsA）含量降低。黃腐酸鉀處理提高了干旱脅迫下SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性，同時提高了AsA和GSH含量，降低了O2?產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量。與紅花大金元相比，干旱脅迫對云煙100影響較大，且黃腐酸鉀對云煙100干旱脅迫傷害的緩解作用較紅花大金元大。因此，黃腐酸鉀可通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性與抗氧化物質含量，協(xié)同清除ROS，緩解干旱脅迫對烤煙幼苗的傷害。

烤煙；干旱脅迫；黃腐酸鉀；活性氧代謝

在正常生長條件下，植物體內(nèi)活性氧自由基（ROS）的產(chǎn)生與清除始終處于動態(tài)平衡，不會對植物本身造成傷害，而在逆境脅迫下，植物體內(nèi)活性氧自由基大量積累，當超出自身清除能力時，就會導致膜脂過氧化和代謝紊亂，從而對植物造成傷害[1-2]。植物體內(nèi)ROS清除系統(tǒng)主要包括由超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶組成的酶促系統(tǒng)和由抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）等抗氧化物質組成的非酶促系統(tǒng)兩大類?？寡趸负涂寡趸镔|在植物抗逆生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。MITTLER等[3]研究表明，增強植物體內(nèi)抗氧化酶活性和抗氧化物質含量是提高植物抵抗逆境脅迫的有效途徑。因此，研究活性氧系統(tǒng)與植物抗逆性之間的關系顯得十分重要。

植物生長調(diào)節(jié)劑已成為植物抗旱性研究的熱點。黃腐酸鉀作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，在干旱、低溫等脅迫下可以調(diào)節(jié)小麥、玉米等植物的抗氧化防御系統(tǒng)[4-6]，同時我們前期研究表明，葉面噴施黃腐酸鉀可以增強烤煙植株葉片光合能力，提高烤煙抗旱性[7]。然而，有關黃腐酸鉀在抗氧化防御方面的研究較少，且植物的抗氧化防御反應存在種間差異，在不同品種或脅迫條件下起主要作用的抗氧化物質或抗氧化酶可能會有所不同。本研究以不同抗旱性烤煙品種紅花大金元和云煙100為材料，采用PEG-6000模擬干旱脅迫的營養(yǎng)液培養(yǎng)法，研究干旱脅迫下葉面噴施黃腐酸鉀對烤煙幼苗葉片中ROS的影響，從活性氧代謝角度探討黃腐酸鉀增強烤煙抗旱能力的生理機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試烤煙品種為紅花大金元和云煙100，分別由國家煙草種質資源中期庫和玉溪中煙種子有限責任公司提供；黃腐酸鉀固體粉劑購置于濟南鑫森源化工有限公司，其中含黃腐酸50.0%，K2O 12.0%；其余試劑均為化學純或分析純，購自國藥集團化學 試劑有限公司。

1.2 試驗設計

采用控制水培試驗，設置4個處理：（1）對照（CK）：葉面噴施蒸餾水；（2）葉面噴施黃腐酸鉀（FA-K）；（3）干旱脅迫+葉面噴施蒸餾水（PEG）；（4）干旱脅迫+葉面噴施黃腐酸鉀（PEG+FA-K）。

試驗于2016年5—7月在中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所青島試驗基地溫室內(nèi)進行，光照為自然光，晝溫（28±2） ℃，夜溫20 ℃左右，相對濕度60%～70%。當幼苗4葉1心時，選長勢一致的健壯幼苗，將根系表面的基質洗凈，定植于裝有1/4 Hoagland營養(yǎng)液pH（5.7±0.2）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天換1次營養(yǎng)液。至幼苗5葉1心時，將每個品種的幼苗隨機分成4組進行處理。每處理18株苗。以聚乙二醇（PEG-6000）作為模擬干旱脅迫的物質，將其加入營養(yǎng)液中，濃度為50 g/kg；黃腐酸鉀濃度為1.0 g/kg，每2天于17:00噴施1次，葉片正反面均勻噴施黃腐酸鉀或蒸餾水，噴至葉片上溶液形成細霧狀均勻小液珠欲滴為止。

分別于處理0、1、3、5、7、9 d時取幼苗生長點下第3片展開真葉進行各指標的測定，試驗設3次重復。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 丙二醛（MDA）含量測定 采用硫代巴比妥酸顯色法測定，參照張志良等[8]的方法。

1.3.2 活性氧自由基含量的測定 超氧陰離子自由基（O2?）產(chǎn)生速率的測定：參考李忠光等[9]的方法。過氧化氫（H2O2）含量的測定：參考CSISZáR等[10]的方法。

1.3.3 抗氧化酶活性的測定 超氧化物岐化酶（SOD）測定：采用氮藍四唑（NBT）光化學還原法測定，參照GONG等[11]的方法。過氧化物酶（POD）測定：采用愈創(chuàng)木酚法，參照YANG等[12]的方法。過氧化氫酶（CAT）測定：采用H2O2氧化還原法測定，參照YANG等[12]的方法。

1.3.4 抗氧化物質含量的測定 抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）的測定采用HUANG等[13]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

方差分析和多重比較（Duncan's法）采用SAS 8.1軟件進行。

2 結 果

2.1 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片MDA含量的影響

由圖1可知，整個處理期間，正常條件（CK）下生長的兩品種葉片中MDA含量基本保持穩(wěn)定，且兩品種間MDA含量無顯著差異。正常條件下，施用黃腐酸鉀處理（FA-K）對MDA含量無顯著影響。干旱脅迫下，MDA含量均隨處理時間呈逐漸 升高的變化趨勢，在第9天時，葉片中MDA含量與對照相比分別增加了83.65%（紅花大金元）和170.75%（云煙100），且處理期間紅花大金元葉片中的MDA含量均低于云煙100，表明干旱脅迫對云煙100的傷害較大。與PEG處理相比，干旱脅迫下黃腐酸鉀處理（PEG+FA-K）第9天時顯著降低了MDA含量，降幅分別為16.43%（紅花大金元）和24.90%（云煙100），但仍高于CK，表明黃腐酸鉀減輕了干旱脅迫下葉片的膜脂過氧化作用，緩解了烤煙幼苗受到的傷害，且對云煙100的減緩效果好于紅花大金元。

圖1 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片MDA含量的影響Fig.1 Effects of fulvic acid potassium on MDA contents in leaves of flue-cured tobacco seedlings under drought stress

2.2 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片O2?產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

由圖2可知，正常條件下，無論施黃腐酸鉀與否，兩品種葉片中O2?產(chǎn)生速率較低且保持相對穩(wěn)定。干旱脅迫下，兩品種葉片中O2?產(chǎn)生速率迅速升高，且均隨脅迫處理時間的推移而逐漸上升，在第9天時，葉片中O2?產(chǎn)生速率與同期對照相比分別增加了61.42%（紅花大金元）和93.65%（云煙100）。與PEG處理相比，脅迫下黃腐酸鉀處理（PEG+FA-K）減少了兩品種葉片中O2?的積累，但仍高于CK，到處理第9天時，葉片中O2?產(chǎn)生速率與其同期對照相比分別增加了37.03%（紅花大金元）和77.31%（云煙100），表明黃腐酸鉀處理可以降低葉片中O2?產(chǎn)生速率，緩解干旱脅迫造成的氧化損傷。

正常條件下，無論施黃腐酸鉀與否，兩品種葉片中H2O2含量沒有顯著波動變化。干旱脅迫下，葉片中H2O2含量隨處理時間逐漸升高，在第9天時，紅花大金元和云煙100葉片中H2O2含量分別為同期各自對照的2.44倍和2.39倍。與PEG處理相比，脅迫下黃腐酸鉀處理（PEG+FA-K）顯著降低了兩品種葉片中的H2O2含量，但仍高于CK，到處理第9天時，葉片中H2O2含量是同期各自對照的1.99倍（紅花大金元）和1.96倍（云煙100），表明黃腐酸鉀可降低干旱脅迫下烤煙幼苗葉片中的H2O2含量，緩解脅迫傷害。

圖2 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片O2?產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響Fig. 2 Effects of fulvic acid potassium on O2?production rate and H2O2contents in leaves of flue-cured tobacco seedlings under drought stress

2.3 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

2.3.1 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片SOD活性的影響 由圖3可知，在整個處理期間，對照組兩品種葉片中SOD活性水平較低且變化平穩(wěn)。正常條件下，施用黃腐酸鉀不同程度地提高了葉片中SOD活性，但與對照相比無顯著差異。干旱脅迫下，葉片中SOD活性與對照相比均顯著升高，隨脅迫處理時間呈先升高后降低的變化趨勢，且整個過程中均高于對照，葉片中SOD活性均在處理第5天時達到最大值，最大值處SOD活性分別為各自對照的3.24倍（紅花大金元）和2.65倍（云煙100），對紅花大金元的提高幅度大于云煙100。與PEG處理相比，黃腐酸鉀處理（PEG+FA-K）進一步提高了兩品種葉片中SOD活性，隨處理時間的推移呈先升高后降低的變化趨勢，于處理第5天時達到最大值，最大值處紅花大金元和云煙100葉片中SOD活性較PEG處理分別升高了18.14%和21.55%。此外，與云煙100相比，紅花大金元保持著較高的SOD活性，且在干旱脅迫下SOD活性增幅較大，這表明紅花大金元自身清除ROS的能力強于云煙100。

圖3 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片SOD活性的影響Fig. 3 Effects of SOD activities in leaves of flue-cured tobacco seedlings under drought stress

2.3.2 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片POD活性的影響 由圖4可知，在整個處理期間，對照組兩品種葉片中POD活性水平基本保持相對穩(wěn)定的變化趨勢。對照條件下施用黃腐酸鉀后，紅花大金元葉片中POD活性無顯著變化，而云煙100葉片中POD活性隨處理時間的推移呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢。干旱脅迫下，兩品種葉片中POD活性均不同程度地升高，隨脅迫處理時間的推移呈先升高后降低的變化趨勢，且整個處理過程中均高于對照，但紅花大金元和云煙100葉片中POD活性分別在處理第5、7天時達到最大值，最大值處分別為各自同期對照的2.09倍和2.19倍。與PEG處理相比，施黃腐酸鉀處理（PEG+FA-K）后兩品種葉片中POD活性進一步提高，其變化趨勢與PEG處理的變化趨勢基本相似，最大值處兩品種葉片中POD活性與各自同期PEG處理相比分別升高了30.55%和26.59%。

2.3.3 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片CAT活性的影響 由圖5可知，在處理期間，對照組兩品種葉片中CAT活性水平基本保持平穩(wěn)趨勢。正常條件下黃腐酸鉀處理（FA-K）不同程度地提高了紅花大金元葉片中CAT活性，在處理第5天顯著高于對照，其余時間無顯著性差異；對云煙100葉片中CAT活性沒有顯著影響。干旱脅迫下，葉片中CAT活性與對照相比顯著升高，隨處理時間表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢，且整個過程中均高于對照，兩品種葉片中CAT活性均在處理第5天時達到最大值，最大值處CAT活性分別為各自對照的2.15倍（紅花大金元）和2.23倍（云煙100）。與PEG處理相比，黃腐酸鉀處理（PEG+FA-K）進一步提高了CAT活性，且其變化趨勢與PEG處理變化趨勢相似，紅花大金元葉片中CAT活性最大值出現(xiàn)在第7天，云煙100葉片中CAT活性最大值出現(xiàn)在第5天，表明黃腐酸鉀作用效果與品種及脅迫時間有關。

圖4 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片POD活性的影響Fig. 4 Effects of POD activities in leaves of flue-cured tobacco seedlings under drought stress

圖5 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片CAT活性的影響Fig. 5 Effects of CAT activities in leaves of flue-cured tobacco seedlings under drought stress

2.4 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片抗氧化物質含量的影響

2.4.1 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片AsA含量的影響 由圖6可知，處理期間，對照組兩品種葉片中AsA含量基本保持穩(wěn)定。正常條件下，黃腐酸鉀處理（FA-K）對葉片中AsA含量沒有顯著影響。干旱脅迫下，兩品種葉片中AsA含量與對照相比均逐漸降低，處理第9天時，分別下降了34.67%（紅花大金元）和46.51%（云煙100）。與PEG處理相比，干旱脅迫下施黃腐酸鉀處理（PEG+FA-K）后減緩了AsA含量的下降，在處理第9天時，AsA含量較PEG處理分別升高了20.27%（紅花大金元）和23.49%（云煙100），表明施黃腐酸鉀可延緩干旱脅迫下葉片中AsA含量的下降。

2.4.2 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片GSH含量的影響 由圖7可知，在整個處理期間，對照組兩品種葉片中GSH含量基本保持穩(wěn)定。正常條件下施用黃腐酸鉀處理（FA-K）后，紅花大金元葉片中GSH含量無顯著變化，而云煙100葉片中GSH含量卻高于對照，但差異不顯著。干旱脅迫下，兩品種葉片中GSH含量較對照均增加，并在達到最大值后逐漸下降；可不同的是，紅花大金元葉片中GSH含量在處理第5天時達到峰值，隨后逐漸降低，但仍顯著高于對照，而云煙100葉片中GSH含量則在處理第3天時達到最大，然后持續(xù)下降，在處理5 d后顯著低于對照，這表明兩烤煙品種之間GSH代謝存在差別。與PEG處理相比，在處理第0～5天，PEG+FA-K處理降低了兩品種葉片中GSH含量；處理5 d以后，PEG+FA-K處理，兩品種葉片中GSH含量要高于PEG處理，第9天時，紅花大金元和云煙100葉片中GSH含量分別達到PEG處理的125.53%和143.43%，這表明施黃腐酸鉀可以提高干旱脅迫下烤煙幼苗體內(nèi)GSH含量，同時顯示GSH含量變化與脅迫時間、品種等有關。

圖6 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片AsA含量的影響Fig. 6 Effects of fulvic acid potassium on AsA contents in leaves of flue-cured tobacco seedlings under drought stress

圖7 黃腐酸鉀對干旱脅迫下烤煙幼苗葉片GSH含量的影響Fig. 7 Effects of fulvic acid potassium on GSH contents in leaves of flue-cured tobacco seedlings under drought stress

3 討 論

抗氧化酶在植物對逆境脅迫的響應機制中具有重要作用[14]。相關研究表明，植物在逆境脅迫下體內(nèi)ROS代謝的動態(tài)平衡將會受到破壞，導致ROS積累，引起膜脂過氧化和代謝紊亂。膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）是反映膜損傷程度和植物抗逆性強弱的重要指標[15-16]。馬文濤等[17-18]研究表明，在干旱脅迫下植物的膜脂質過氧化程度與O2?和H2O2的積累量呈顯著正相關。本研究中，與對照相比，干旱脅迫下，紅花大金元和云煙100葉片中O2?產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量顯著增加，且隨脅迫時間延長呈增加趨勢，原因可能是干旱逆境下植物體內(nèi)活性氧代謝失衡致使O2-迅速積累和SOD活性增加，進而導致其初級氧化產(chǎn)物H2O2的含量隨之升高，加劇脂質過氧化反應，從而引起MDA含量增加。已有研究表明[19]，干旱條件下外源黃腐酸可增強植株體內(nèi)活性氧自由基的清除能力，減輕膜脂過氧化損傷。本研究結果也證實，干旱脅迫下，烤煙幼苗葉片中SOD、POD及CAT活性隨脅迫時間呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在峰值處均顯著高于各自對照，同時干旱脅迫下外源黃腐酸鉀處理進一步提高了烤煙幼苗葉片中抗氧化酶活性，顯著降低了烤煙幼苗葉片中O2?產(chǎn)生速率及H2O2和MDA含量，表明黃腐酸鉀可誘導抗氧化酶以清除ROS，減輕膜脂過氧化程度。

逆境條件下，植物體內(nèi)AsA和GSH作為非酶促抗氧化物質在ROS清除中發(fā)揮重要作用[20-21]。相關研究表明，干旱脅迫條件下，AsA和GSH含量在小麥[22]中顯著下降，而在油菜[23]、大麥[24]等作物中卻上升。本研究中，干旱脅迫下，烤煙幼苗葉片中AsA含量較對照顯著下降；GSH含量隨脅迫時間增加呈先升高后降低的變化趨勢，原因可能是在干旱脅迫下，烤煙體內(nèi)激活應激反應來清除活性氧自由基，保護膜的完整性，但隨脅迫時間推移，長時間的脅迫導致活性氧的產(chǎn)生和積累超過了自身的清除能力，造成了不可逆的傷害。此外，干旱脅迫下，GSH含量在紅花大金元和云煙100中的變化也不盡相同，說明不同烤煙品種之間GSH代謝存在差別。干旱脅迫下黃腐酸鉀處理提高了兩品種葉片中AsA和GSH含量，這可能是因為黃腐酸鉀直接或間接誘導AsA和GSH的合成，促進其含量提高，但具體機制需進一步研究。

4 結 論

干旱脅迫下，烤煙幼苗體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除失衡，O2?產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著增加，較高的ROS導致MDA含量也顯著增加，同時誘導抗氧化酶活性和抗氧化物質含量升高，但ROS的積累超過了抗氧化系統(tǒng)的清除能力，對烤煙幼苗產(chǎn)生了傷害，抑制了其正常生長。黃腐酸鉀處理可提高干旱脅迫下烤煙幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性和抗氧化物含量，降低ROS的積累，減輕膜脂過氧化，且對抗旱性較弱的品種作用更明顯，表明黃腐酸鉀能在一定程度上維持ROS產(chǎn)生與清除之間的平衡，緩解干旱脅迫對植物造成的氧化損傷。但關于對其他生理過程的影響需進一步研究。

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Effects of Fulvic Acid Potassium on Reactive Oxygen Metabolism of Flue-cured Tobacco Seedlings Grown under Drought Stress

ZHAO Yongchang1,2, SONG Wenjing1, DONG Jianxin1*, QIU Chunli3, KUANG Shuai1, GUAN Ennai1,2, ZHUO Qicui1,2, LIU Dongmei3

(1. Institute of Tobacco Research of CAAS, Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing, Ministry of Agriculture, Qingdao Tobacco Resources and Environment Feild Station of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Qujing Tobacco Company of Yunnan Province, Qujing, Yunnan 655000, China)

To reveal the roles of reactive oxygen metabolism in drought-resistance improvement by fulvic acid potassium in flue-cured tobacco seedlings, the effects of fulvic acid potassium (foliar spraying) on ROS, autioxidant enzyme activities, antioxidant content and MDA content in leaves of flue-cured tobacco with different drought resistance, drought resistant cultivar (honghuadajinyuan) and drought sensitive cultivar (yunyan100) grown under drought stress were investigated by hydroponic experiments. The results showed that the O2–production rate, H2O2and MDA contents in leaves of flue-cured tobacco seedlings were increased, the activities of SOD, POD and CAT were all significantly enhanced under drought stress, and the content of GSH was significantly increased during the initial period of drought stress, however, the content of AsA was decreased. Under stress conditions, foliar spraying of fulvic acid potassium could effectively enhance the activities of antioxidase and the amount of antioxidants, and decrease the content of superoxide anion, hydrogen peroxide and MDA. Compared with Honghuadajinyuan, there was greater influence on Yunyan100 under drought stress, and fulvic acid potassium could effectively alleviate the stress-induced damage to Yunyan100. These results indicated that fulvic acid potassium could alleviate stress-induced damage to flue-cured tobacco seedlings and improve its drought tolerance through increasing of antioxidants activities/contents.

flue-cured tobacco; drought stress; fulvic acid potassium; reactive oxygen metabolism

S572.01

1007-5119（2017）04-0029-08

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.04.005

中國煙草總公司重點項目“滇東北煙區(qū)干旱與低溫脅迫下烤煙生產(chǎn)關鍵調(diào)控技術研究與應用”（110201402013）； 中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC03-2016）

趙永長（1991-），男，碩士研究生，主要從事煙草栽培與生理生態(tài)研究。E-mail：yongchang0874@163.com *通信作者，E-mail：dongjianxin@caas.cn

2017-03-14

2017-05-12