譚 軍，周冀衡*，李 強(qiáng)，張 毅，陳麗鵑，周路闊,2，鄧?yán)?/p>

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草研究院，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128； 2.湖南省煙草公司郴州市公司，湖南 郴州 423000；3.郴州市桂陽(yáng)縣煙草公司，湖南 桂陽(yáng) 424400）

氮素形態(tài)對(duì)煙草黑脛病發(fā)生的影響

譚 軍1，周冀衡1*，李 強(qiáng)1，張 毅1，陳麗鵑1，周路闊1,2，鄧?yán)?

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草研究院，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128； 2.湖南省煙草公司郴州市公司，湖南 郴州 423000；3.郴州市桂陽(yáng)縣煙草公司，湖南 桂陽(yáng) 424400）

為尋找控制煙草黑脛病發(fā)生的有效措施，研究了硝態(tài)氮、銨態(tài)氮及其配比液對(duì)煙草黑脛病菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)以及煙株次生代謝物和抗病性的影響。結(jié)果表明，硝態(tài)氮、銨態(tài)氮及其混合液均可以加速煙草黑脛病游動(dòng)孢子的萌發(fā)，二者混合溶液更有利于黑脛病菌絲的生長(zhǎng)。隨著溶液中銨態(tài)氮濃度的升高，煙株根系木質(zhì)素、纖維素和MDA含量以及SOD、POD、PAL活性顯著升高，增強(qiáng)了煙株的抗病性，從而使其發(fā)病率和病情指數(shù)顯著下降。相關(guān)性分析表明，煙株黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)與其根系木質(zhì)素、MDA含量和SOD、POD、PAL活性均極顯著負(fù)相關(guān)，黑脛病發(fā)病率與纖維素含量顯著負(fù)相關(guān)。因此，煙株黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)與其次生代謝物密切相關(guān)，銨態(tài)氮可以顯著降低煙草黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)，但硝態(tài)氮和銨態(tài)氮最適配比及田間抗病效果還需進(jìn)行大量相關(guān)田間試驗(yàn)研究。

煙草黑脛?。坏匦螒B(tài)；發(fā)病率

煙草黑脛病是由黑脛病病菌引起的一種土傳性病害，是煙草毀滅性病害之一，在煙草整個(gè)生育期均可發(fā)病，給我國(guó)乃至全世界煙草種植造成了巨大損失[1-2]。氮肥是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的營(yíng)養(yǎng)元素。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要施用的氮肥形態(tài)。不同氮素形態(tài)能影響作物生長(zhǎng)發(fā)育和根系形態(tài)結(jié)構(gòu)，影響作物抗病性[3]。研究表明銨硝配施能增強(qiáng)杭白菊抗菊花斑枯病的能力[4]，硝態(tài)氮單施可以增強(qiáng)大白菜[5]、香蕉[6]等作物的抗病性。不同氮素形態(tài)也能影響病原菌生長(zhǎng)繁殖及其致病性。研究表明硝態(tài)氮可以抑制番茄鐮刀菌萎蔫病、玉米細(xì)菌性枯萎病，銨態(tài)氮可以抑制西瓜、甜瓜根腐病[7]。氮肥形態(tài)與病原菌和作物抗病性有密切關(guān)系[8-9]。目前，煙草種植上對(duì)黑脛病防治主要以培育抗病性品種[10-12]和施用化學(xué)藥劑為主[13]，以輪作[14]等栽培措施為輔，但從氮肥形態(tài)角度研究其對(duì)煙草黑脛病生長(zhǎng)繁殖和煙株抗病性影響的還鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本論文研究了不同氮素形態(tài)及其配比對(duì)煙草黑脛病游動(dòng)孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)以及煙苗抗病性的影響，以期為煙草黑脛病的防治和氮肥的合理施用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

綠色熒光蛋白標(biāo)記的煙草黑脛病菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)單衛(wèi)星教授惠贈(zèng)，煙草品種為K326，10% V8培養(yǎng)基。

1.2 氮素形態(tài)對(duì)煙草黑脛病游動(dòng)孢子萌發(fā)的影響

設(shè)置5個(gè)不同氮素配比處理，即NO3?∶NH4+分別為10∶0、7∶3、5∶5、3∶7、0∶10，NO3?由Ca(NO3)2提供，NH4+由(NH4)2SO4提供，總氮濃度為10 mmol/L，用CaCl2補(bǔ)充銨態(tài)氮處理中缺少的Ca元素，使各處理Ca含量相等。配好后置于121 ℃下滅菌20 min。參照鄭小波[15]的方法制備煙草黑脛病游動(dòng)孢子，并調(diào)整其濃度為1×104mL。參照文獻(xiàn)[16]取滅菌的凹面載玻片，向其凹穴中滴加滅菌氮素溶液15 μL，并加等量游動(dòng)孢子懸浮液。以等量無(wú)菌水代替氮營(yíng)養(yǎng)液作對(duì)照。每個(gè)處理3次重復(fù)。于28 ℃黑暗保濕培養(yǎng)，每隔2小時(shí)取樣用熒光顯微鏡（奧林巴斯IX71）觀察其萌發(fā)情況。

1.3 氮素形態(tài)對(duì)煙草黑脛病菌絲生長(zhǎng)的影響

將不同配比的氮素溶液分別添加到V8培養(yǎng)基中配制成含氮量為5 mmol/L的10% V8瓊脂培養(yǎng)基，高壓滅菌后倒入平板。用直徑為5 mm的滅菌打孔器在活化7 d長(zhǎng)滿黑脛病菌絲的平板上取菌餅，然后用接種針將其分別挑取到平板中心，每個(gè)培養(yǎng)皿1個(gè)菌餅，3次重復(fù)。以添加等量無(wú)菌水代替氮營(yíng)養(yǎng)液作對(duì)照。置于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。每24小時(shí)采用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑。

1.4 氮素形態(tài)對(duì)煙苗黑脛病菌發(fā)生情況及其生理特征的影響

采用1.2的方法配制總氮濃度為5 mmol/L，其他營(yíng)養(yǎng)元素與Hoagland配方相同的營(yíng)養(yǎng)液。試驗(yàn)在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草研究院溫室中進(jìn)行，光照強(qiáng)度15 000 Lux，光照周期為12 h/12 h，溫度26～28 ℃（光照）/18～20 ℃（黑暗），濕度70%～80%。采用常規(guī)漂浮育苗方法育苗，待其長(zhǎng)至4葉1心時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗洗去基質(zhì)后置于71 cm×46 cm×18 cm的塑料盆中，用自制帶孔的聚氯乙烯泡沫板固定煙苗。每盆50株，每個(gè)處理6盆，共計(jì)300株。并先用1/2濃度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)5 d，再分別置于總氮濃度為5 mmol/L的不同氮素形態(tài)配比的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d，然后從各處理中分別隨機(jī)挑選3盆，置于濃度為1×107mL的黑脛病游動(dòng)孢子懸浮液中浸根24 h，以在無(wú)菌水中浸根相同時(shí)間作為對(duì)照處理。營(yíng)養(yǎng)液每5天更換1次。每2天用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)液pH使之維持在6.8～7.0。接菌后繼續(xù)處理10 d，然后統(tǒng)計(jì)煙苗病害情況，并取煙苗根部測(cè)定生理指標(biāo)。根據(jù)GB/T 23222—2008標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)病害情況[17]。按照下列公式計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。發(fā)病率(%)=發(fā)病植株/植株總數(shù)×100 %；病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值）×100。木質(zhì)素含量測(cè)定采用溴乙酰方法[18]，纖維素含量和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性參照文獻(xiàn)[19]測(cè)定，SOD活性和POD活性分別采用NBT（氮藍(lán)四唑）法和愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[20]，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定[20]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2013和SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。文中的數(shù)據(jù)均為（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）格式。

2 結(jié) 果

2.1 氮素形態(tài)對(duì)煙草黑脛病游動(dòng)孢子萌發(fā)的影響

由表1可知，在6 h和8 h各處理組的孢子萌發(fā)率均極顯著高于對(duì)照組（p=0.000）。當(dāng)處理超過(guò)8 h，各處理組與對(duì)照組的孢子萌發(fā)率差距縮小，到12 h無(wú)顯著差異（p=0.520）。此外，硝態(tài)氮、銨態(tài)氮混合處理的孢子萌發(fā)率總體高于其單獨(dú)處理，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。因此，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮可以加速煙草黑脛病游動(dòng)孢子的萌發(fā)，但對(duì)孢子的最終萌發(fā)率無(wú)顯著影響。

2.2 氮素形態(tài)對(duì)煙草黑脛病菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2可知，與對(duì)照相比，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮單獨(dú)處理對(duì)煙草黑脛病菌絲生長(zhǎng)均無(wú)顯著促進(jìn)作用，但二者混合溶液總體有利于菌絲的生長(zhǎng)，方差分析表明，差異達(dá)到顯著水平。因此，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮混合溶液有利于煙草黑脛病菌絲的生長(zhǎng)。

表1 不同氮素形態(tài)及配比對(duì)煙草黑脛病游動(dòng)孢子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different nitrogen forms and their ratios on the germination of tobacco black shank zoospores

表2 不同氮素形態(tài)及配比對(duì)煙草黑脛病菌絲生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of different nitrogen forms and their ratios on the mycelial growth of tobacco black shank

2.3 氮素形態(tài)對(duì)煙苗黑脛病發(fā)病率及病情指數(shù)的影響

由表3可知，隨著溶液中銨態(tài)氮濃度增加，煙苗黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)都極顯著下降（p=0.000）。全硝態(tài)氮處理的煙苗發(fā)病率和病情指數(shù)分別是全銨態(tài)氮處理的2.09倍和2.05倍。當(dāng)溶液中NO3?∶NH4+由10∶0到7∶3時(shí)，煙苗發(fā)病率 下降幅度最大，達(dá)20.67%。因此，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮不同配比對(duì)煙草黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)都有極顯著影響。

表3 不同氮素形態(tài)及配比對(duì)煙苗黑脛病發(fā)病 情況的影響Table 3 Effects of different nitrogen forms and their ratios on the occurrence of tobacco black shank at seedling stage

2.4 氮素形態(tài)對(duì)煙苗根系生理指標(biāo)的影響

由圖1可知，煙苗根系木質(zhì)素含量隨培養(yǎng)液中銨態(tài)氮比例增加而顯著升高。木質(zhì)素含量增幅最大是由10∶0到7∶3時(shí)，增加了2.37倍， 其次是NO3?∶NH4+由3∶7到0∶10時(shí)，增加了1.88倍。纖維素含量隨培養(yǎng)液中銨態(tài)氮比例增加先升高后降低，當(dāng)溶液NO3?∶NH4+由10∶0到7∶3時(shí)，其含量顯著升高；當(dāng)溶液NO3?∶NH4+由3∶7到0∶10時(shí)，其含量顯著下降。因此，氮素形態(tài)對(duì)煙苗根系木質(zhì)素和纖維素含量有顯著影響。

由圖2可知，煙苗根系SOD和POD活性均隨培養(yǎng)液中銨態(tài)氮比例增加而顯著升高。當(dāng)溶液NO3?∶NH4+由10∶0到7∶3時(shí)，SOD和POD活性均顯著升高；NO3?∶NH4+由5∶5到3∶7時(shí)，兩者活性均極顯著升高；NO3?∶NH4+由7∶3到5∶5時(shí)，兩者活性均無(wú)顯著變化。因此，氮素形態(tài)及配比對(duì)煙苗根系SOD和POD活性有顯著影響。

圖1 不同氮素形態(tài)及配比對(duì)煙苗根系木質(zhì)素、 纖維素含量的影響Fig. 1 Effects of different nitrogen forms and their ratios on the contents of lignin and cellulose of tobacco seedling roots

圖2 不同氮素形態(tài)及配比對(duì)煙苗根系SOD和 POD活性的影響Fig. 2 Effects of different nitrogen forms and their ratios on SOD and POD activity of tobacco seedling roots

由圖3可見(jiàn)，PAL活性和MDA含量均隨培養(yǎng)液中銨態(tài)氮比例增加而顯著升高。當(dāng)溶液NO3?∶NH4+由10∶0到7∶3時(shí)，PAL活性極顯著升高，MDA含量顯著升高；NO3?∶NH4+由7∶3到5∶5時(shí)，PAL活性顯著提高，MDA含量無(wú)顯著變化；NO3?∶NH4+由5∶5到0∶10時(shí)，PAL活性和MDA含量均極顯著升高。因此，氮素形態(tài)及配比對(duì)煙苗根系PAL活性和MDA含量有顯著影響。

圖3 不同氮素形態(tài)及配比對(duì)煙苗根系PAL活性和 MDA含量的影響Fig. 3 Effects of different nitrogen forms and their ratios on PAL activities and MDA content of tobacco seedling roots

2.5 煙苗生理指標(biāo)與黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)的相關(guān)分析

上述研究表明，隨著溶液NO3?∶NH4+由10∶0到0∶10，煙苗黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著下降，而根系木質(zhì)素、纖維素含量、SOD活性等生理指標(biāo)均顯著升高，為了深入研究他們之間的關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表4所示。煙苗發(fā)病率和病情指數(shù)與煙苗根系木質(zhì)素含量、SOD活性、POD活性、PAL活性和MDA含量均極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），煙苗發(fā)病率與纖維素含量顯著負(fù)相關(guān)（p=0.046）。

表4 生理指標(biāo)與黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)的相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis of physiological indicators with disease incidence and disease index

3 討 論

氮素是植物、微生物生長(zhǎng)繁殖必需的營(yíng)養(yǎng)元素，亦被稱為“生命元素”。已有大量研究表明，氮肥形態(tài)與致病菌及作物抗病性有密切關(guān)系[6-8,10-11]。本研究表明，硝態(tài)氮、銨態(tài)氮及其不同配比雖不顯著影響游動(dòng)孢子最終萌發(fā)率，但均可以加速其萌發(fā)；兩者混合溶液更有利于黑脛病菌絲生長(zhǎng)；銨態(tài)氮可以提高煙苗抗病性，從而顯著降低煙草黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)。前人報(bào)道銨態(tài)氮可以降低草莓黑腐病發(fā)病率和番茄尖孢鐮刀菌致病力[21]，硝態(tài)氮可以降低香蕉枯萎病[6]和大白菜斑點(diǎn)病的發(fā)生[5]。由此可知，氮素形態(tài)對(duì)不同病原菌致病力的影響存在較大差異。這可能是因?yàn)椴煌【w內(nèi)與氮代謝相關(guān)的途徑存在較大差異。前人研究表明，高濃度銨態(tài)氮對(duì)煙草有毒害脅迫[22]。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善抵御各種脅迫的防御機(jī)制。SOD、POD等保護(hù)酶系在植物抵御脅迫中起著重要作用。當(dāng)由脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧超出保護(hù)酶清除能力時(shí)就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂膜系統(tǒng)被氧化，使得MDA含量升高[23]。本研究表明，全硝態(tài)氮處理時(shí)煙苗根系中的SOD、POD活性、MDA含量都最低，表明此時(shí)細(xì)胞中活性氧含量最低，細(xì)胞膜系統(tǒng)受損害程度也最輕。當(dāng)NO3?∶NH4+由10∶0到5∶5時(shí)，SOD、POD活性和MDA含量雖有增加，但較為平緩，表明此時(shí)SOD、POD等保護(hù)酶將細(xì)胞內(nèi)活性氧維持在較低水平，細(xì)胞膜系統(tǒng)受損害程度較輕。當(dāng)NO3?∶NH4+由5∶5到0∶10時(shí)，SOD、POD活性和MDA含量增加劇烈，表明此時(shí)細(xì)胞內(nèi)積累了大量的活性氧，保護(hù)酶活性雖然增加，但仍未能將其及時(shí)清理，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)受損。

煙苗根系木質(zhì)素、纖維素含量和PAL活性隨著培養(yǎng)液中銨態(tài)氮濃度升高而升高。相關(guān)分析表明，煙苗發(fā)病率和病情指數(shù)與煙苗根系木質(zhì)素、MDA含量以及SOD、POD、PAL活性均呈極顯著負(fù)相關(guān)。木質(zhì)素是酚類(lèi)聚合物，主要存在于細(xì)胞壁纖維素形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。木質(zhì)素含量增加可以增加細(xì)胞壁的厚度，增強(qiáng)纖維素間的膠黏作用，能有效阻止病原菌對(duì)作物的侵染[24]。所以木質(zhì)素的增加可以提高作物抵御病害侵染和增強(qiáng)抗逆性的能力。本研究結(jié)果與前人研究的木質(zhì)素含量增加可以增強(qiáng)黃瓜[25]、獼猴桃[26]、杭白菊抗病性[4]的結(jié)果基本一致。PAL酶是植物細(xì)胞內(nèi)酚類(lèi)化合物合成的關(guān)鍵酶，其活性增強(qiáng)可以有效提高酚類(lèi)物質(zhì)的含量。酚類(lèi)物質(zhì)除其本身是抗菌物質(zhì)外，也是木質(zhì)素合成的前提物質(zhì)，所以其變化趨勢(shì)與木質(zhì)素基本一致。該研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[27]。POD既直接參與細(xì)胞內(nèi)活性氧的清除，又可以將酚類(lèi)化合物氧化成醌類(lèi)化合物，參與植保素、木質(zhì)素等物質(zhì)的生物合成[28]。所以POD活性與煙苗發(fā)病率和病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，銨態(tài)氮可以顯著降低煙草黑脛病的發(fā)病率和病情指數(shù)。因此在煙草育苗及種植過(guò)程中可以通過(guò)合理施用銨態(tài)氮肥來(lái)提高煙草抗黑脛病的能力。但考慮到高濃度的銨態(tài)氮對(duì)煙苗生長(zhǎng)發(fā)育和煙葉品質(zhì)有負(fù)面影響[29-30]。所以二者最佳配比以及田間施用效果還需開(kāi)展大量相關(guān)田間試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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Effects of Nitrogen Forms on the Occurrence of Tobacco Black Shank

TAN Jun1, ZHOU Jiheng1*, LI Qiang1, ZHANG Yi1, CHEN Lijuan1, ZHOU Lukuo1,2, DENG Liping3

(1. Institute of Tobacco, College of Biological Science and Technology, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2. Chenzhou Tobacco Company, Chenzhou, Hunan 423000, China; 3. Guiyang Branch of Chenzhou Tobacco Company, Guiyang, Hunan 424400, China)

In order to find effective measures to control tobacco black shank, effects of nitrate, ammonium and their different ratios on spore germination and mycelial growth of tobacco black shank as well as the secondary metabolism and disease resistance of tobacco were studied. The results showed that the germination of zoospores of tobacco black shank was accelerated by nitrate, ammonium and their mixed solutions, and the mycelia of tobacco black shank grew better in their mixed solutions. With the increasing of ammonium concentration in solutions, the contents of lignin, cellulose and MDA and the activities of SOD, POD and PAL in tobacco roots increased significantly, while the incidence and the disease index of tobacco black shank decreased significantly. The correlation analysis showed that there was a extremely significantly negative correlation between the incidence/disease index of tobacco black shank and the contents of lignin and MDA and the activities of SOD, POD and PAL(p＜0.01), and there was a remarkable negative correlation between the incidence of tobacco black shank and the content of cellulose. So the results revealed that the incidence and the disease index of tobacco black shank are closely related to the secondary metabolites, which can be significantly reduced by ammonium application. However, a large number of field trials need to be carried out to study the optimal ratio of nitrate and ammonium nitrogen under field conditions.

tobacco black shank; nitrogen forms; incidence

S435.72

1007-5119（2017）04-0080-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.04.013

湖南省煙草公司郴州市公司項(xiàng)目“水旱兩段式育苗技術(shù)研究與應(yīng)用”（2016009）

譚 軍（1985-），男，在讀博士，主要從事煙草生理生化研究。E-mail：649766283@qq.com。*通信作者，E-mail：jhzhou2006@163.com

2017-02-15

2017-03-11