張園園，張貴，張鍵，張光，周洪友，趙君*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特010018；2.烏拉特前旗農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古烏拉特前旗014400）

不同寄主來源輪枝孢菌的交互致病性1

張園園1，張貴1，張鍵1，張光2，周洪友1，趙君1*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特010018；2.烏拉特前旗農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古烏拉特前旗014400）

為了明確不同寄主來源的輪枝孢菌是否存在交互致病性，對(duì)來源于向日葵、棉花、茄子、生菜和馬鈴薯5種不同寄主植物上的10株輪枝孢菌的生物學(xué)特性，如菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、生理小種、交配型和致病力分化進(jìn)行研究，并利用大麗輪枝孢菌不同生理小種和交配型的特異引物對(duì)供試大麗輪枝孢菌菌株進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）檢測(cè)。結(jié)果表明，不同寄主來源的輪枝孢菌在菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速度上存在顯著差異。PCR檢測(cè)結(jié)果表明：除了來自生菜的大麗輪枝孢菌Ls16-1為1號(hào)生理小種外，其余8株不同寄主來源的大麗輪枝孢菌均為2號(hào)生理小種；所有供試大麗輪枝孢菌菌株的交配型均為MAT1-2-1型。此外，采用紙缽撕底蘸根法將不同寄主來源的輪枝孢菌分別接種向日葵、棉花、茄子和馬鈴薯。結(jié)果顯示，不同寄主來源的菌株對(duì)上述不同寄主均表現(xiàn)出不同程度的致病力，但都對(duì)自身分離寄主的致病性表現(xiàn)最強(qiáng)。綜上表明，不同寄主來源的輪枝孢菌對(duì)不同寄主存在交互致病性，但均對(duì)其分離寄主的致病性表現(xiàn)最強(qiáng)。

輪枝孢菌；交互致病性；生理小種；交配型

SummaryVerticillium spp.is a group of soil-borne pathogen causing a yellow wilt disease on different kinds of hosts, such as cottons,potatoes,sunflowers and egg-plants,etc.So far,Verticillium dahliae and Verticillium alboatrum have been the most dominant species isolated from different diseased hosts.

In this study,V.dahliae from sunflower,cotton,eggplant,lettuce and potato and V.alboatrum from potato were selected to study the colonial morphology,growth speed,and pathogenic specificity.Their race and mating types were also identified by specific primers.

The results showed that variable colonial morphology and growth speed were observed in all the tested isolates.Four different kinds of colonial morphologies were classified based on the amount of aerial mycelium and the number of microsclerotia.However,the difference on the morphology of conidiophores and conidia was not obvious among all the tested isolates.The growth speed was also variable after 10 d of culture on potato D-glucose agar(PDA)medium.The strain Ls17-6 from lettuce grew the fastest,while Hn-1 from cotton grew the slowest.The difference of growth speed was alsoobserved among the isolates obtained from the same host.For example,Hn-1 isolated from cotton was significantly lower compared with the other two isolates.All the tested isolates were characterized as race 2,except for Ls16-1 isolated from lettuce as race 1;the mating type of all the tested strains was MAT1-2-1.The pathogenic specificity was studied using root dipping inoculation way.Twenty-one days post-inoculation(dpi),the pathogenicity of isolates always showed the highest virulence on its own host.For example,Sx5 which was isolated from sunflower showed the highest disease index of 52.50, followed by the isolate V991 from cotton with the disease index of 41.25.The same result was also obtained on cotton.For example,the isolate V991 showed the highest pathogenicity,and Icd3-33 also from cotton listed in the second position among all the tested isolates.

In conclusion,the pathogenicity of Verticillium spp.on the different hosts is variable,but shows the strongest pathogenicity in the specific host.Besides,the isolates from lettuce always showed the lowest virulence on all the tested hosts,indicating lettuce may be used as a rotation host for other crops to control the yellow wilt in the future.

引起植物黃萎病的病原菌統(tǒng)稱為黃萎病菌，包括大麗輪枝孢菌（Verticillium dahliae Kleb.）、黑白輪枝孢菌（Verticillium alboatrum Reinke&Berthold）、三體輪枝孢菌（Verticillium tricorpus Isaac）、云狀輪枝孢菌（Verticillium nubilum Pethybr.）、鱷梨根腐病原菌（Verticillium theobromae Turc.）[1]，以及大麗輪枝孢菌長(zhǎng)孢變種（Verticillium dahliae var.longisporum Stark）、變黑輪枝孢菌（Verticillium nigrescens Pethybr.）等[2-3]；但是引起作物黃萎病的病原菌只有大麗輪枝孢菌和黑白輪枝孢菌2種[4-5]。目前，黃萎病菌在馬鈴薯（Solanum tuberosum）[6]、向日葵（Helianthus annuus L.）[7]、茄子（Solanum melongena L.）[8]、花椰菜（Brassica oleracea L.）、陸地棉（Gossypium hirsutum L.）[9]、生菜（Lactuca sativa var. ramosa）[10]等寄主上造成的危害均有報(bào)道。如我國(guó)云南省茄子黃萎病呈現(xiàn)出逐年加重的趨勢(shì)，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失達(dá)80%以上[8]；我國(guó)新疆棉花黃萎病發(fā)病田占棉花總播種面積的58.2%，其中病情指數(shù)達(dá)5.0以上的棉田占28.1%[9]；我國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)向日葵黃萎病的發(fā)生面積占向日葵總播種面積的7%左右[11]，而在寧夏部分地區(qū)的發(fā)生面積占向日葵播種面積高達(dá)46.9%[12]，嚴(yán)重影響向日葵的產(chǎn)量和品質(zhì)；美國(guó)南部地區(qū)馬鈴薯黃萎病嚴(yán)重影響馬鈴薯塊莖的質(zhì)量，造成馬鈴薯減產(chǎn)[6]。

盡管黃萎病菌的寄主范圍十分廣泛，但是它在不同寄主上表現(xiàn)出的致病力不同，如從可可（Theobroma cacao L.）和草莓（Fragaria spp.）上分離得到的大麗輪枝孢菌對(duì)可可和草莓的致病力強(qiáng)于對(duì)其他寄主植物的致病力[13-14]；從胡椒（Piper nigrum L.）、薄荷（Mentha haplocalyx L.）和煙草（Nicotiana tabacum L.）等寄主植物上分離到的大麗輪枝孢菌[4,10,13-14]以及從紫花苜蓿（Medicago sativa L.）和啤酒花（Humulus lupulus L.）寄主植物上分離得到的黑白輪枝孢菌對(duì)寄主都表現(xiàn)出一定的寄生?；訹15-16]。此外，從朝鮮薊（Cynara scolymus L.）、甜椒（Capsicum annuum var.grossum）、油橄欖（Olea europaea L.）、辣椒（Capsicum annuum L.）、陸地棉、茄子、薄荷、生菜、馬鈴薯、草莓、番茄（Lycopersicon esculentum L.）、西瓜（Citrullus lanatus L.）上分離到的輪枝孢菌也有交互侵染的報(bào)道[4]。但是，向日葵黃萎病菌（大麗輪枝孢菌）在馬鈴薯、茄子、棉花等輪作作物上的致病力分化研究尚未有報(bào)道。

已有研究結(jié)果表明，不同寄主來源的大麗輪枝孢菌只有1號(hào)和2號(hào)2個(gè)生理小種。USAMI等[17]和SCHAIBLE等[18]分別對(duì)番茄和生菜的大麗輪枝孢菌遺傳多樣性進(jìn)行了研究，開發(fā)出1號(hào)和2號(hào)生理小種的特異引物，并利用這些引物鑒定表明，生菜和番茄大麗輪枝孢菌都存在著1號(hào)和2號(hào)生理小種的分化[17-19]。由于大麗輪枝孢菌的1號(hào)生理小種只在缺少抗病基因的寄主上具有致病性，而2號(hào)生理小種能夠克服抗病基因所介導(dǎo)的抗病性[20-21]，因此，國(guó)際上利用Ve1基因設(shè)計(jì)引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來檢測(cè)寄主基因組中是否含有Ve1基因，從而快速鑒別侵染這些寄主的大麗輪枝孢菌的生理小種類型。同時(shí)，國(guó)外還利用含有Ve1基因的番茄品種“ACE VF”與不含Ve1基因的番茄品種“Early pak 7”、含有Vr1基因的生菜品種“Momotaro”與不含有Vr1基因的生菜品種“Oogata-fukuju”作為生理小種的鑒別寄主，分別鑒定了番茄和生菜中大麗輪枝孢菌的生理小種類型[19]。

子囊菌的有性生殖由配位型基因MAT來調(diào)控。配位型基因編碼的蛋白往往是一種能夠調(diào)控與有性交配相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[22]。大麗輪枝孢菌是一種具有MAT1-1-1和MAT1-2-1 2種交配型（mating type）的異宗配合真菌[17]。如果2株大麗輪枝孢菌菌株要進(jìn)行有性生殖，它們必須分別攜帶有MAT1-1和MAT1-2配位基因[23-25]。ATALLAH等[26]的研究結(jié)果表明，在美國(guó)加利福尼亞州采集的生菜大麗輪枝孢菌種群中MAT1-1-1所占的比例僅為30%，其余菌株的交配型均為MAT1-2-1，表明在大麗輪枝孢菌群體中存在著MAT1-1-1和MAT1-2-1 2種交配型。

本研究以分離自向日葵、馬鈴薯、茄子、生菜以及棉花的輪枝孢菌為研究材料，通過對(duì)比不同寄主來源輪枝孢菌的形態(tài)學(xué)特征，確定不同寄主來源的輪枝孢菌的生理小種及交配型，評(píng)價(jià)輪枝孢菌在向日葵、馬鈴薯、茄子、棉花等寄主之間的交互侵染能力，進(jìn)而明確其在不同寄主間是否存在致病力分化現(xiàn)象，旨在填補(bǔ)我國(guó)向日葵黃萎病菌的研究空白，也為不同作物黃萎病綜合防控措施中輪作對(duì)象的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：Sx5（Verticillium dahliae）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子植物病理室向日葵病害菌種庫(kù)保存；Pt1（Verticillium dahliae）、Pt2（Verticillium dahliae）、Pt3（Verticilium alboatrum）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院周洪友教授提供；V991（Verticillium dahliae）、Hn-1（Verticillium dahliae）、Icd3-33（Verticillium dahliae）由西北農(nóng)林科技大學(xué)肖恩時(shí)研究員提供；Xn由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院景嵐教授提供。以來源于生菜的輪枝孢菌菌株為參考菌株，由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校SUBBARAO教授惠贈(zèng)，其中：菌株Ls16-1（Verticilliumdahliae）是1號(hào)生理小種，交配型是MAT1-2-1型；菌株Ls17-6（Verticillium dahliae）是2號(hào)生理小種，交配型是MAT1-2-1型。上述菌株中除了Pt3為黑白輪枝孢菌（Verticillium alboatrum）外，其余9株均為大麗輪枝孢菌（Verticillium dahliae）。供試輪枝孢菌菌株的具體信息如表1所示。

表1 輪枝孢菌菌株代碼及其寄主信息Table 1Codes of Verticillium isolates and their hosts

供試的寄主材料均為市售品種，其中：向日葵品種為食葵雜交種“LD5009”；棉花品種為“石抗”；茄子品種為“快圓茄”；馬鈴薯品種為“夏坡地”。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato D-glucose agar,PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1 000 mL。麥麩培養(yǎng)基：麥麩經(jīng)蒸餾水浸潤(rùn)后分裝于300 mL的罐頭瓶中，121℃高溫滅菌30 min。

供試試劑：10×Taq緩沖液、dNTPs、Taq酶和DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（均購(gòu)于北京天根生物科技有限公司）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）引物（由北京厚生博泰科技有限公司合成）。

供試儀器：TC-25H PCR擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 不同寄主來源的輪枝孢菌菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速度的測(cè)定

將10個(gè)不同寄主來源的輪枝孢菌菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃活化7～10 d，在菌落邊緣的幼嫩菌絲處用直徑為9 mm的滅菌打孔器打出菌餅，接種在PDA培養(yǎng)基中央，25℃恒溫培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)。利用十字交叉法測(cè)量并記錄培養(yǎng)5、10、15和18 d的菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.2 不同寄主來源的輪枝孢菌生理小種的鑒定

用CTAB法提取大麗輪枝孢菌的基因組DNA[27]，采用特異引物對(duì)不同寄主來源的大麗輪枝孢菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。大麗輪枝孢菌1號(hào)生理小種的特異引物對(duì)[24]如下。vdr1：5'-TGAAGTAGCCGATAGCTTT GTCTTGCCCG-3'；vdr2：5'-TGTCTGGATTAATCGCC GCAATAGAGACG-3'。2號(hào)生理小種的特異引物對(duì)[19]如下。vd2F：5'-ACTTAACGAAAGCATGCGC-3'；vd2R：5'-CTTGACTTGCCGGCTCC-3'。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：ddH2O 19 μL，10×Taq緩沖液2.5 μL，dNTPs（各2.5 mmol/L）1.25 μL，引物對(duì)（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq酶（2.5 U/μL）0.25 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，退火45 s（其中引物vdr1/vdr2的退火溫度為59℃，vd2F/vd2R的退火溫度為58℃），72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過觀察是否擴(kuò)增出與正對(duì)照相同位置的條帶來確定其生理小種的類型。1.2.3不同寄主來源輪枝孢菌交配型的鑒定

大麗輪枝孢菌的交配型鑒定[3,25]可分別通過MAT1-1-1型的特異引物（Alf3：5'-CGATCGCGATATCG GCAAGG-3'；MAT11r：5'-CAGTCAGATCCAACCTGC TGGCC-3'）和MAT1-2-1型的特異引物（HMG21f：5'-CGGCCGCCCAATTCGTACATCC-3'；MAT21r：5'-CATGCCTTCCATGCCATTAGTAGCC-3'）[18]完成。DNA提取方法和PCR反應(yīng)體系（除MAT1-1-1和MAT1-2-1的退火溫度均為57℃外）同1.2.2節(jié)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：MAT1-1-1型目的片段大小約為600 bp；MAT1-2-1的片段大小約為300 bp。

1.2.4 不同寄主來源輪枝孢菌致病力的測(cè)定

將不同寄主來源的輪枝孢菌經(jīng)PDA平板活化5～7 d后，從菌落邊緣挑取菌塊接入麥麩培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)7～14 d。用無菌水沖洗麥麩培養(yǎng)基，4層滅菌紗布過濾后獲得分生孢子液。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將分生孢子液的濃度調(diào)至1×107mL－1后備用。

用70%的乙醇浸泡向日葵、棉花、茄子種子5 min后，用無菌水沖洗2～3遍，播種到裝有滅菌土的營(yíng)養(yǎng)缽（高10 cm，直徑10 cm）中；馬鈴薯塊莖切塊后也播種到裝有滅菌土的營(yíng)養(yǎng)缽中。當(dāng)向日葵、棉花、茄子幼苗長(zhǎng)到2～4片真葉時(shí)，將準(zhǔn)備好的分生孢子液采用紙缽撕底蘸根法[28]進(jìn)行人工接種。其中：對(duì)于向日葵、棉花、茄子，每個(gè)菌株分別接種5缽，每缽4株幼苗，1缽幼苗作為空白對(duì)照；對(duì)于馬鈴薯寄主，每個(gè)菌株接種10缽幼苗（每缽2株），2缽幼苗作為空白對(duì)照。接種后的幼苗置于22～23℃溫室條件下繼續(xù)培養(yǎng)。分別記錄接種后第7、14、21和28天時(shí)各寄主植物的發(fā)病等級(jí)[29]，并計(jì)算病情指數(shù)。以21 d的病情指數(shù)繪制表格。

黃萎病發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[29]如下。0級(jí)：健株，無癥狀；1級(jí)：25%（含25%）以下的葉片表現(xiàn)褪綠、黃化、萎蔫、枯死等癥狀；2級(jí)：25%～50%（含50%）的葉片表現(xiàn)癥狀，植株矮化；3級(jí)：50%～75%（含75%）的葉片表現(xiàn)癥狀，植株矮化；4級(jí)：75%以上的葉片表現(xiàn)出嚴(yán)重癥狀，植株枯萎死亡。

病情指數(shù)=[∑(各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)別)/(調(diào)查總株數(shù)×4)]×100。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SAS 9.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同寄主來源輪枝孢菌菌落形態(tài)的比較

所有供試菌株培養(yǎng)7 d后的菌落近圓形，其菌絲特別是氣生菌絲的生長(zhǎng)量與微菌核形成數(shù)量呈現(xiàn)明顯的差異。由圖1可見：以Ls16-1、Ls17-6和Pt3為代表的菌株其菌落能夠產(chǎn)生茂密的白色氣生菌絲，但沒有微菌核產(chǎn)生；而菌株Sx5、V991、Hn-1、Icd3-33和Xn的菌落既能產(chǎn)生白色氣生菌絲又能產(chǎn)生一定數(shù)量的微菌核，其中，菌株Sx5、V991、Hn-1能夠形成比較密集的氣生菌絲，菌株Icd3-33和Xn能形成稀疏的氣生菌絲和一定量的微菌核；而菌株P(guān)t1和Pt2能夠產(chǎn)生大量的微菌核和少量、稀疏的氣生菌絲。不同寄主來源的輪枝孢菌菌株產(chǎn)生的分生孢子形態(tài)相似，均為無色、單孢、橢圓形、近橢圓形；分生孢子梗均呈現(xiàn)輪枝狀排列。

圖1 不同寄主來源的輪枝孢菌菌株的菌落形態(tài)Fig.1Colonial morphology of Verticillium spp.isolated from different hosts

2.2 不同寄主來源輪枝孢菌菌落生長(zhǎng)速度的比較

由圖2可見：不同寄主來源的輪枝孢菌菌株的生長(zhǎng)速度在培養(yǎng)10 d后差異顯著。其中：來自生菜的Ls17-6菌株生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑為4.15 cm；其次是來源茄子的菌株Xn，菌落直徑為3.86 cm；來自棉花的菌株Hn-1的生長(zhǎng)速度最慢，菌落直徑僅為2.99 cm。培養(yǎng)到第15天時(shí)，從茄子上分離到的輪枝孢菌菌株Xn的生長(zhǎng)速度明顯加快，菌落直徑為4.71 cm；其次是來源于生菜的菌株Ls17-6，菌落直徑為4.65 cm；從棉花上分離到的輪枝孢菌菌株Hn-1的生長(zhǎng)速度最慢，菌落直徑僅有3.69 cm。當(dāng)培養(yǎng)到第18天時(shí)，來自不同寄主的各菌株之間生長(zhǎng)速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

從圖2也可以看出，采集于不同地點(diǎn)的相同寄主來源的輪枝孢菌，其生長(zhǎng)速度也表現(xiàn)出一定的差異。其中：來自棉花的3個(gè)菌株在培養(yǎng)5、10和15 d時(shí)的生長(zhǎng)速度均表現(xiàn)出明顯的差異，相對(duì)于其他2個(gè)菌株，菌株Hn-1的生長(zhǎng)速度一直為最慢；而來自生菜的2個(gè)菌株在培養(yǎng)第10天時(shí)就表現(xiàn)出差異，其中LS17-6的生長(zhǎng)速度略快于LS16-1；來源于馬鈴薯的3個(gè)菌株的生長(zhǎng)速度也在培養(yǎng)第10天時(shí)出現(xiàn)一定的差異，菌株P(guān)t2的生長(zhǎng)速度略快于其他2個(gè)菌株，而來自馬鈴薯的黑白輪枝孢菌Pt3的生長(zhǎng)速度和相同寄主的大麗輪枝孢菌Pt1的生長(zhǎng)速度相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 不同寄主來源輪枝孢菌生理小種的鑒定

利用國(guó)際通用的輪枝孢菌的生理小種1和生理小種2的特異引物對(duì)不同寄主來源輪枝孢菌的生理小種進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3所示。除了生菜黃萎病菌Ls16-1為1號(hào)生理小種外，其余8株不同寄主來源的黃萎病菌均為2號(hào)生理小種。

2.4 不同寄主來源輪枝孢菌的交配型鑒定

利用大麗輪枝孢菌的交配型MAT1-1-1和MAT1-2-1的特異引物對(duì)不同寄主來源大麗輪枝孢菌的交配型進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，所有不同寄主來源的大麗輪枝孢菌均為MAT1-2-1交配型（圖4）。說明MAT1-2-1交配型是不同寄主來源大麗輪枝孢菌的優(yōu)勢(shì)交配型。

2.5 不同寄主來源輪枝孢菌的致病力測(cè)定

為了比較不同寄主來源的輪枝孢菌菌株在不同寄主植物的交互侵染能力，采用傷根接種法進(jìn)行人工接種，并調(diào)查了接種7、14、21和28 d后的植株發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)。其中，接種21 d后不同寄主的病情指數(shù)如表2所示。結(jié)果表明，不同寄主來源的輪枝孢菌菌株對(duì)不同寄主植物的致病力存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（P＜0.05）。根據(jù)不同寄主對(duì)供試菌株的抗性反應(yīng)，對(duì)不同寄主來源的輪枝孢菌的致病力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果歸納如下。

圖2 不同寄主來源輪枝孢菌菌株生長(zhǎng)速度比較Fig.2Comparison of the growth speed of Verticillium spp.isolated from different hosts

圖3 不同寄主來源大麗輪枝孢菌生理小種的PCR鑒定Fig.3Race type identification of Verticillium dahliae isolated from different hosts by PCR

圖4 不同寄主來源大麗輪枝孢菌MAT1-2-1交配型的PCR鑒定Fig.4Identification of mating type MAT1-2-1 in Verticillium dahliae isolated from different hosts by PCR

向日葵寄主：接種2周后，下部葉片首先開始出現(xiàn)癥狀，葉尖或葉緣局部黃化，隨著組織失調(diào)、青萎，開始向葉脈組織發(fā)展，最后變褐、干枯，莖基部和葉柄微管束呈褐色。后期發(fā)病株的全部葉片都有顯著病變，干枯矮化。所有供試輪枝孢菌菌株都能侵染向日葵品種“LD5009”，但發(fā)病程度呈現(xiàn)出一定的差異。其中，來自向日葵的菌株Sx5對(duì)向日葵品種“LD5009”表現(xiàn)出最強(qiáng)的致病力，病情指數(shù)高達(dá)52.50，其次為棉花菌株V991，病情指數(shù)為41.25。來源于生菜的菌株Ls16-1和Ls17-6表現(xiàn)出最弱的致病力，病情指數(shù)分別為16.67和25.00。來自茄子的菌株Xn在向日葵上表現(xiàn)出的致病力居中，病情指數(shù)為40.00。來自馬鈴薯的3個(gè)菌株在向日葵上表現(xiàn)出的致病力僅次于向日葵SX5、棉花V991和茄子菌株Xn，這3株馬鈴薯菌株的病情指數(shù)介于33.75和38.75之間，相互間差異不顯著。而來自棉花的3個(gè)菌株在向日葵上呈現(xiàn)出致病力分化現(xiàn)象，其中菌株V991在向日葵寄主上表現(xiàn)出的致病力高于其他2份菌株。

棉花寄主：接種1周后，植株下層葉片出現(xiàn)褪綠黃化病斑，隨著病情的發(fā)展可形成枯葉、光稈，維管束則部分褐變，植株矮化、萎蔫。所有供試菌株均能夠侵染棉花品種“石抗”。其中：來源于棉花的菌株V991的致病力最強(qiáng)，病情指數(shù)為80.00；其次為來源于棉花的另一個(gè)菌株Icd3-33，病情指數(shù)為62.50。來自馬鈴薯的3株菌Pt1、Pt2和Pt3在棉花上的病情指數(shù)分別為55.00、57.50和40.00，其致病力僅次于來自棉花的菌株Icd3-33。來自棉花的菌株Hn-1在棉花上表現(xiàn)出的致病力最弱，病情指數(shù)僅為12.50。在馬鈴薯的3個(gè)供試菌株中，黑白輪枝孢菌Pt3的致病力在棉花上最弱，病情指數(shù)為40.00。來源于茄子的黃萎病菌Xn在棉花上也表現(xiàn)出相對(duì)較弱的致病力，病情指數(shù)為41.67。與向日葵寄主測(cè)定結(jié)果相似，來源于生菜的菌株Ls16-1和Ls17-6的致病力最弱，其病情指數(shù)分別為15.00和10.00。

茄子寄主：接種1周后，葉緣及葉脈間出現(xiàn)褪綠黃化病斑，病斑不斷擴(kuò)大和聯(lián)合，顏色也由黃色變?yōu)楹稚⒉粩嘤上虏肯蛏喜堪l(fā)展至整株；有時(shí)只半邊葉或半邊植株發(fā)病，即俗稱的“半邊瘋”。所有供試菌株在茄子寄主上表現(xiàn)出的病情指數(shù)都低于50.00。其中：從茄子寄主分離到的菌株Xn對(duì)茄子的致病力最強(qiáng)，病情指數(shù)為43.75；其次為來自生菜的1號(hào)生理小種菌株Ls16-1，病情指數(shù)為36.67，而來自生菜的2號(hào)生理小種Ls17-6的病指僅為22.50。來自馬鈴薯的Pt1、Pt2和Pt3菌株在茄子寄主上的表現(xiàn)和前面2個(gè)寄主截然不同，其中黑白輪枝孢菌Pt3表現(xiàn)出的致病力最強(qiáng)，病情指數(shù)為36.67。致病力表現(xiàn)最弱的菌株是來自棉花的V991，其病情指數(shù)僅為14.58，而這一菌株在棉花、向日葵和馬鈴薯上都表現(xiàn)出極強(qiáng)的致病力。

表2 不同寄主來源的輪枝孢菌對(duì)不同寄主的致病力測(cè)定結(jié)果Table 2Cross pathogenicity test of Verticillium spp.isolated from different hosts

馬鈴薯寄主：接種2周后，葉片的側(cè)脈之間變黃，逐漸轉(zhuǎn)褐，有時(shí)葉片稍往上卷，自頂端或邊緣起枯死；輕病植株生長(zhǎng)緩慢，下部葉片變褐干枯，嚴(yán)重的整個(gè)植株萎蔫枯死，剖莖可見維管束變成褐色。來自馬鈴薯的黑白輪枝孢菌Pt3表現(xiàn)出最強(qiáng)的致病力，病情指數(shù)為54.17；其次為來自茄子的菌株Xn，病情指數(shù)為47.08；表現(xiàn)最弱的為生菜菌株Ls16-1以及棉花黃萎病菌株Hn-1，其病情指數(shù)均為25.00。

3 討論

本試驗(yàn)不同寄主來源的10株輪枝孢菌按菌落形態(tài)可初步分為4種培養(yǎng)類型：第1類以菌株Ls16-1、Ls17-6和Pt3為代表，能夠產(chǎn)生茂密的白色氣生菌絲，但沒有微菌核產(chǎn)生；第2類以菌株Sx5、V991、Hn-1為代表，能夠形成比較密集的氣生菌絲和一定數(shù)量的微菌核；第3類以菌株Icd3-33和Xn為代表，只能形成稀疏的氣生菌絲和一定量的微菌核；第4類以菌株P(guān)t1和Pt2為代表，能夠產(chǎn)生大量的微菌核和少量、稀疏的氣生菌絲。在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)到10 d時(shí)，不同寄主來源的供試菌株的生長(zhǎng)速度差異顯著；而不同培養(yǎng)型菌株的生長(zhǎng)速度與其致病力沒有明顯的相關(guān)性。這與任杰等[30]的研究結(jié)果一致，即不同培養(yǎng)型的向日葵黃萎病菌存在致病力的分化，且菌株的致病力強(qiáng)弱與其生長(zhǎng)速度沒有相關(guān)性。

已有的研究表明，生理小種的種群結(jié)構(gòu)與其地理位置有相關(guān)性。GURUNG等[19]研究發(fā)現(xiàn)，所有來自美國(guó)沃森維爾地區(qū)的黃萎病菌株均為2號(hào)生理小種，而所有來自薩利納斯地區(qū)的黃萎病菌株均為1號(hào)生理小種。而本研究結(jié)果表明，除SUBBARAO教授惠贈(zèng)的美國(guó)生菜大麗輪枝孢菌菌株LS16-1為1號(hào)生理小種外，其余8株不同寄主且不同地域來源的大麗輪枝孢菌均為2號(hào)生理小種：說明大麗輪枝孢菌的寄主類型、采樣地點(diǎn)與其生理小種類型無明顯相關(guān)性。由于我國(guó)不同寄主植物來源的輪枝孢菌的優(yōu)勢(shì)小種都是2號(hào)生理小種，且所有供試菌株的交配型均被鑒定為MAT1-2-1交配型，說明無性生殖是我國(guó)不同寄主輪枝孢菌的主要繁殖方式。這一結(jié)論與USAMI等[17]對(duì)329株生菜黃萎病菌的研究結(jié)果一致，即：311株病菌為1號(hào)生理小種，占供試菌株的94.52%；328株病菌為MAT1-2-1交配型，占供試菌株的99.69%。

目前對(duì)大麗輪枝孢菌（V.dahliae）以及黑白輪枝孢菌（V.alboatrum）寄主?；砸延袕V泛的報(bào)道[1,7,10,31-32]。有研究指出，來自番茄和蘿卜（Raphanus sativus L.）的黃萎病菌均可侵染薄荷，但來自馬鈴薯、茄子、黃秋葵（Abelmoschus esculentus L.）和甜瓜（Cucumis melo L.）的黃萎病菌株則對(duì)薄荷沒有致病性。同樣，棉花黃萎病菌株雖然不能侵染豇豆（Vigna unguiculata L.）、甜瓜和西瓜，但對(duì)棉花、番茄和紅花（Carthamus tinctorius L.）具有不同程度的致病性[33]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果和上述研究結(jié)果一致，如向日葵黃萎病菌株Sx5既可以侵染向日葵，也可以侵染棉花、茄子和馬鈴薯，但在不同寄主上的致病性卻不盡相同。供試菌株對(duì)各自寄主均表現(xiàn)出最強(qiáng)的致病力，而對(duì)寄主以外的其他寄主則表現(xiàn)出不同程度的致病力，說明從不同寄主上分離到的黃萎病菌具有一定的寄生?；?，但在其他不同的寄主上存在著致病力分化的現(xiàn)象。這與BHAT等[10]在番茄、茄子、甜椒和十字花科植物上發(fā)現(xiàn)的黃萎病菌存在寄生?；缘慕Y(jié)果一致。不同寄主來源的黃萎病菌在不同寄主上表現(xiàn)出致病性分化的現(xiàn)象，可能是長(zhǎng)期進(jìn)化過程中菌株與寄主植物之間相互作用的結(jié)果。類似這種黃萎病菌-寄主植物相互作用的模式已經(jīng)在馬鈴薯、向日葵、棉花上進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道[34-35]。

在本研究中，我國(guó)不同寄主來源的輪枝孢菌生理小種是單一類型，即2號(hào)生理小種，以及單一的交配型MAT1-2-1。本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)全國(guó)各地分離到的向日葵黃萎病菌生理小種和交配型進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，所有向日葵黃萎病菌生理小種都是2號(hào)小種且交配型都是MAT1-2-1型（待發(fā)表），說明無性繁殖可能是目前我國(guó)不同作物黃萎病菌的主要繁殖方式，這也預(yù)示我國(guó)黃萎病菌的遺傳變異程度較小。而不同寄主來源的輪枝孢菌能夠進(jìn)行交互侵染，且在其分離寄主上表現(xiàn)出強(qiáng)致病性，該結(jié)果為今后作物黃萎病綜合防控措施中輪作對(duì)象的選擇提供了一定的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

通過對(duì)向日葵、棉花、茄子、生菜和馬鈴薯5種不同寄主來源的大麗輪枝孢菌（V.dahliae）和馬鈴薯的黑白輪枝孢菌（V.alboatrum）在不同寄主上交互侵染力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，除來源于生菜的大麗輪枝孢菌外，其他供試菌株對(duì)各自寄主都表現(xiàn)出最強(qiáng)的致病性，對(duì)寄主以外的其他寄主表現(xiàn)出不同程度的致病性：說明大麗輪枝孢菌具有一定程度的寄生?；浴３它S萎病菌株LS16-1為1號(hào)生理小種外，其余8株不同寄主來源的大麗輪枝孢菌均被鑒定為2號(hào)生理小種：說明大麗輪枝孢菌的寄主來源、采集樣點(diǎn)和其生理小種類型沒有明顯的相關(guān)性。由于我國(guó)不同寄主植物大麗輪枝孢菌的優(yōu)勢(shì)小種都是2號(hào)生理小種，且所有供試菌株的交配型均被鑒定為MAT1-2-1交配型：說明無性繁殖可能是供試的不同寄主大麗輪枝孢菌的主要繁殖形式。

[1]KLOSTERMAN S J,ATALLAH Z K,VALLAD G E,et al. Diversity,pathogenicity,and management of Verticillium species. Annual Review of Phytopathology,2009,47:39-62.

[2]BARBARA D J,CLEWES E.Plant pathogenic Verticillium species:Howmanyofthemarethere?MolecularPlant Pathology,2003,4(4):297-305.

[3]INDERBITIZIN P,BOSTOCK R M,DAVIS R M,et al. Phylogenetics and taxonomy of the fungal vascular wilt pathogen Verticillium with the descriptions of five new species.PLoS One, 2011,6(12):e28341.

[4]QIN Q M,VALLAD G E,WU B M,et al.Phylogenetic analyses of phytopathogenic isolates of Verticillium spp.Phytopathology, 2006,96(6):582-592.

[5]QIN Q M,VALLED G E,SUBBARAO K V.Characterization of Verticillium dahliae and V.tricorpus isolates from lettuce and artichoke.Plant Disease,2008,92(1):69-77.

[6]ROWE R C,POWELSON M L.Potato early dying:Management challenges in a changing production environment.Plant Disease, 2002,86(11):1184-1193.

[7]曹雄,孟慶林,劉繼霞,等.不同向日葵品種資源對(duì)黃萎病抗性的田間鑒定.作物雜志,2014(1):67-72. CAO X,MENG Q L,LIU J X,et al.The identification of resistance of different sunflower varieties to sunflower Verticilium wilt in fields.Crops,2014(1):67-72.(in Chinese with English abstract)

[8]王順黨.茄子黃萎病綜合防治技術(shù)探討.蔬菜,2009(7):20-21. WANG S D.Study on integrated control technique of eggplant Verticillium wilt.Vegetables,2009(7):20-21.(in Chinese)

[9]劉海洋,王偉,張仁福,等.新疆主要棉區(qū)棉花黃萎病發(fā)生概況.植物保護(hù)學(xué)報(bào),2015,41(3):138-142. LIU H Y,WANG W,ZHANG R F,et al.Occurrence overviews of cotton Verticillium wilt in Xinjiang.Plant Protection,2015,41(3): 138-142.(in Chinese with English abstract)

[10]BHAT R G,SUBBARAO K V.Host range specificity in Verticillium dahliae.Phytopathology,1999,89(12):1218-1225.

[11]曹麗霞,徐利敏,云曉鵬,等.內(nèi)蒙古地區(qū)向日葵主要病蟲害發(fā)生現(xiàn)狀及研究建議.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2009(6):83-85. CAO L X,XU L M,YUN X P,et al.Occurrence of main diseases and pests on sunflower in Inner Mongolia and some suggestion for futureresearch.InnerMongoliaAgriculturalScienceand Technology,2009(6):83-85.(in Chinese with English abstract)

[12]王玲,王淑紅,何建國(guó),等.向日葵病害發(fā)生原因與防治對(duì)策.甘肅科技,2010,26(7):162-163. WANG L,WANG S H,HE J G,et al.Occurrence reasons and control strategies of sunflower diseases.Gansu Science and Technology,2010,26(7):162-163.(in Chinese)

[13]RESENDE M L V,FLOOD J,COOPER R M.Host specialization of Verticillium dahliae,with emphasis on isolates from cocoa (Theobroma cacao).Plant Pathology,1994,43(1):104-111.

[14]GORDON T R,KIRKPATRICK S C,HANSEN J,et al. Response of strawberry genotypes to inoculation with isolates of Verticillium dahliae differing in host origin.Plant Pathology, 2006,55(6):766-769.

[15]OKOLI C A N,CARDER J H,BARBARA D J.Restriction fragment length polymorphisms(RFLPs)and the relationships of somehost-adaptedisolatesofVerticilliumdahliae.Plant Pathology,1994,43(1):33-40.

[16]CORRELL J C,GORDON T R,MCCAIN A H.Vegetative compatibilityandpathogenicityofVerticilliumalboatrum. Phytopathology,1988,78(8):1017-1021.

[17]USAMI T,ITOH M,MORII S,et al.Involvement of two different types of Verticillium dahliae in lettuce wilt in Ibaraki Prefecture, Japan.Journal of General Plant Pathology,2012,78(5):348-352.

[18]SCHAIBLE L,CANNON O S,WADDOUPS V.Inheritance of resistance to Verticillium wilt in a tomato cross.Phytopathology, 1951,41(11):986-990.

[19]GURUNG S,SHORT D P,ATALLAH Z K,et al.Clonal expansion of Verticillium dahliae in lettuce.Phytopathology, 2014,104(6):641-649.

[20]VALLAD G E,QIN Q M,GRUBE R,et al.Characterization of race-specific interactions among isolates of Verticillium dahliae pathogenic on lettuce.Phytopathology,2006,96(12):1380-1387.

[21]HAYES R J,MARUTHACHALAM K,VALLAD G E,et al. Selection for resistance to Verticillium wilt caused by race 2 isolates of Verticillium dahliae in accessions of lettuce(Lactuca sativa L.).HortScience,2011,46(2):201-206.

[22]METZENBERG R L,GLASS N L.Mating type and mating strategies in Neurospora.BioEssays,1990,12(2):53-59.

[23]TURGEON B G,YODER O C.Proposed nomenclature for mating type genes of filamentous ascomycetes.Fungal Genetics and Biology,2000,31(1):1-5.

[24]DE JONGE R,VAN ESSE H P,MARUTHACHALAM K,et al. Tomato immune receptor Ve1 recognizes effector of multiple fungal pathogens uncovered by genome and RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,2012, 109(13):5110-5115.

[25]USAMI T,ITOH M,AMEMIYA Y.Asexual fungus Verticillium dahliae is potentially heterothallic.Journal of General Plant Pathology,2009,75(6):422-427.

[26]ATALLAH Z K,MARUTHACHALAM K,DU TOIT L,et al. Population analyses of the vascular plant pathogen Verticillium dahliae detect recombination and transcontinental gene flow. Fungal Genetics and Biology,2010,47(5):416-422.

[27]STEWARTT C N J,VIA L E.A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications.Biotechniques,1993,14(5):748-750.

[28]石磊巖,王波,文學(xué).我國(guó)棉花黃萎病菌類型分化及培養(yǎng)特性研究.植物保護(hù)學(xué)報(bào),1993,20(3):247-252. SHI L Y,WANG B,WEN X.Study on the type differentiation and cultural characteristics of cotton Verticillium wilt in China. Acta Phytophylacica Sinica,1993,20(3):247-252.(in Chinese with English abstract)

[29]FLOOD J,ISAAC L,MILTON J M.Reactions of some cultivars of lucerne to various isolates of Verticillium alboatrum.Plant Pathology,1978,27(4):166-169.

[30]任杰,張貴,曹雄,等.向日葵黃萎病菌不同培養(yǎng)型產(chǎn)毒能力和致病力分化.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2014,36(3):393-397. REN J,ZHANG G,CAO X,et al.Crude toxin production ability andpathogenicitydifferentiationonsunflowerVerticillium dahliae.Chinese Journal of Oil Crop Sciences,2014,36(3):393-397.(in Chinese with English abstract)

[31]CHANG R J,EASTBURN D M.Host range of Verticillium dahliae from horseradish and pathogenicity of strains.Plant Disease,1994,78(5):503-506.

[32]GOUD J C,TERMORSHUIZEN A J.Pathogenicity and virulence of the two Dutch VCGs of Verticillium dahliae to woody ornamentals.European Journal of Plant Pathology,2002,108(8): 771-782.

[33]SCHNATHORSTWC,MATHREDE.Hostrangeand differentiation of a severe form of Verticillium alboatrum in cotton.Phytopathology,1966,56(10):1155-1161.

[34]ALKHER H,HADRAMI A E,RASHID K Y,et al.CrosspathogenicityofVerticilliumdahliaebetweenpotatoand sunflower.European Journal of Plant Pathology,2009,124(3): 505-519.

[35]KOROLEV N,PEREZ-ARTES E,MERCADO-BLANCO J,et al. Vegetative compatibility of cotton-defoliating Verticillium dahliae in Israel and its pathogenicity to various crop plants.European Journal of Plant Pathology,2008,122(4):603-617.

Cross pathogenicity of Verticillium spp.isolated from different hosts.

Journal of Zhejiang University (Agric.&Life Sci.),2017,43(4):483-492

ZHANG Yuanyuan1,ZHANG Gui1,ZHANG Jian1,ZHANG Guang2,ZHOU Hongyou1,ZHAO Jun1*(1.College of Agronomy, Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China;2.Wulateqianqi Agricultural Department,Wulateqianqi 014400,Inner Mongolia,China)

Verticillium spp.;cross pathogenicity;race type;mating type

S 432.44

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.09.281

國(guó)家向日葵產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-16)；國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201103016）。

趙君(http://orcid.org/0000-0001-7207-9289)，E-mail:zhaojun@imau.edu.cn

（First author）：張園園(http://orcid.org/0000-0003-4656-2001)，E-mail:1092403865@qq.com

2016-09-28；接受日期（Accepted）：2016-12-16