王立東 成文玉 金紅星（河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130）

乙醛脫氫酶基因敲除對明串珠菌產(chǎn)甘露醇的影響

王立東 成文玉 金紅星（河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130）

為了提高甘露醇產(chǎn)量，研究了乙醛脫氫酶基因敲除對明串珠菌碳代謝的影響。利用四環(huán)素抗性基因構(gòu)建了攜帶抗性標(biāo)記的同源重組載體；將攜帶抗性標(biāo)記的同源重組載體酶切產(chǎn)生無抗性標(biāo)記的同源重組載體；經(jīng)過兩次同源重組獲得了乙醛脫氫酶基因敲除菌株即突變菌株。三基因敲除的突變菌株LeuΔdtsΔldhΔaldh甘露醇產(chǎn)量（9.35 g/L）比原始菌株（7.87 g/ L）提高18.8%，乙醇含量產(chǎn)量下降了62%。

明串珠菌；基因敲除；乙醛脫氫酶；甘露醇；乙醇

甘露醇是一種己六醇，在醫(yī)藥、食品、電子和化工等眾多領(lǐng)域均得到廣泛的應(yīng)用[1]。目前，工業(yè)生產(chǎn)甘露醇主要有兩種工藝：海藻提取法在生產(chǎn)過程產(chǎn)生大量廢水、污染嚴(yán)重、收率低；催化加氫法的產(chǎn)率較低、且有山梨醇伴生。實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)甘露醇的方法有兩種：酶轉(zhuǎn)化法在體系中加入昂貴的輔酶，不經(jīng)濟(jì)；微生物發(fā)酵法不產(chǎn)生其它多元醇等副產(chǎn)物且條件溫和。產(chǎn)甘露醇的微生物中，明串珠菌由于基因組較小、轉(zhuǎn)化率較高，因此有著明顯的優(yōu)勢。明串珠菌是進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵的G+，是FDA認(rèn)可的GRAS菌，因沒有醛縮酶而不進(jìn)行糖酵解，底物通過PPK途徑而脫氫并產(chǎn)生能量[2]。

本文探討了乙醛脫氫酶（aldh）基因敲除對明串珠菌產(chǎn)甘露醇的影響，從而揭示了碳代謝中通量變化規(guī)律，為明串珠菌的遺傳育種奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株與質(zhì)粒：腸膜明串珠菌CGMCC1.10327，大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒pTA2-Tet、大腸桿菌-明串珠菌穿梭載體pCW4均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)：大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)；明串珠菌用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)。

內(nèi)切酶為TAKARA的，Taq DNA聚合酶為天津謙泰的，化學(xué)試劑為分析純。

所用到的引物列于表1。

表1 引物

1.2 方法

1.2.1 乙醛脫氫酶基因部分序列的克隆

參照Vingataramin等的方法[3]提取明串珠菌染色體DNA并做模板，PCR擴(kuò)增了乙醛脫氫酶基因aldh，構(gòu)建了載體pTA2-aldh。

1.2.2 aldh的同源重組載體與互補(bǔ)型載體的構(gòu)建

pTA2-aldh做模板，以P1-P2、P3-P4為引物，分別擴(kuò)增aldh的前、后同源臂aldh-L和aldh-R，并分別插入到pTA2-Tet質(zhì)粒的KpnI和XhoI、PstI和XbaI酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建了攜帶抗生素抗性標(biāo)記的同源重組載體pTA2-aldhL-Tet-aldh。用EcoRI酶切pTA2-aldhL-Tet-aldhR而去除四環(huán)素表達(dá)盒，獲得了無抗生素抗性標(biāo)記的同源重組載體pTA2-aldhL-aldhR。

以明串珠菌染色體DNA為模板，利用P5-P6引物PCR擴(kuò)增了aldh基因表達(dá)盒，插入到pCW4的XhoI酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建了互補(bǔ)型表達(dá)載體pCW4-aldh。

圖1 同源重組載體與互補(bǔ)型載體的驗(yàn)證Fig.1 Verification of homologous recombinant vectors and complementary vector

圖3 甘露醇產(chǎn)量的比較Fig 3 comparison of mannitol production

圖4 乙醇產(chǎn)量的比較Fig 4 comparison of ethanol production

圖2 突變菌株的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR validation of mutant strains1、Marker 2、原始菌株3、Leu△aldh-Tet 4、Leu△aldh

1.2.3 明串珠菌的電擊轉(zhuǎn)

參照張舟等的電擊轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒導(dǎo)入到明串珠菌受體細(xì)胞中。導(dǎo)入pTA2-aldhL-Tet-aldhR而獲得攜帶抗生素抗性標(biāo)記的同源重組菌LeuΔaldh-Tet，再導(dǎo)入pTA2-aldhL-aldhR而獲得無抗生素抗性標(biāo)記的同源重組菌LeuΔaldh，LeuΔaldh中導(dǎo)入pCW4-aldh而獲得互補(bǔ)型菌株LeuΔaldh/aldh。

1.2.4 發(fā)酵

將明串珠菌同源重組菌株與原始菌株分別接種于裝有5 mL MRS中，120 r/min振搖培養(yǎng)16 h后，以10%的接種量接種于裝有20 mL MRS中，培養(yǎng)20 h后檢測甘露醇和乙醇[4-5]。

2 結(jié)果

2.1 同源重組載體pTA2-aldhL-Tet-aldhR和pTA2-aldhL-aldhR的構(gòu)建

先將前同源臂插入到pTA2-Tet而獲得重組載體pTA2-aldhL-Tet，再插入后同源臂而獲得同源重組載體pTA2-aldhLTet-aldhR，重組載體的酶切驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳見圖1A和1B，從圖可以看出符合預(yù)期的結(jié)果。無抗生素抗性標(biāo)記的同源重組載體pTA2-aldhL-aldhR的酶切驗(yàn)證電泳見圖1C，互補(bǔ)型表達(dá)載體pCW4-aldh的酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖1D，從圖可以看出符合預(yù)期的結(jié)果。

2.2 突變菌株的PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證突變菌株的aldh序列是否發(fā)生改變，分別提取基因失活菌株（發(fā)生一次同源重組的菌株即攜帶抗生素抗性標(biāo)記的）、基因敲除菌株（發(fā)生兩次同源重組的菌株即抗生素抗性標(biāo)記的）和原始菌株的染色體DNA并做模板，利用P7-P8引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖2，從圖2可見符合預(yù)期結(jié)果。

2.2 甘露醇和乙醇的產(chǎn)量

比較了原始菌株、LeuΔdts[6]、LeuΔdtsΔldh、LeuΔdtsΔldhΔaldh和LeuΔaldh的甘露醇產(chǎn)量，見圖3，從圖3可知，單敲除aldh的（8.26 g/L）比原始菌株產(chǎn)量（7.87 g/L）提高5%，疊加敲除三個(gè)基因的（9.35 g/L）比原始菌株產(chǎn)量提高18.8%。比較原始菌株、LeuΔdtsΔldhΔaldh和LeuΔaldh的乙醇產(chǎn)量，從圖4可知，單敲除aldh的和疊加敲除三個(gè)基因的比原始菌株產(chǎn)量減少60%左右。

從圖3和圖4可以看出，互補(bǔ)型菌株LeuΔaldh/aldh的甘露醇和乙醇產(chǎn)量恢復(fù)到原始菌株的水平，由此可見，突變菌株LeuΔaldh的甘露醇產(chǎn)量提升和乙醇產(chǎn)量下降是aldh基因敲除引起的。

3 討論

在微生物細(xì)胞內(nèi)，NADH為還原力將果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇。史建波[7]為了降低發(fā)酵成本，以蔗糖替換了果糖；張舟[6]為提高蔗糖的轉(zhuǎn)化率敲除了葡聚糖蔗糖酶基因；田云飛為提高甘露醇產(chǎn)量敲除了D-乳酸脫氫酶基因；本研究為提高甘露醇產(chǎn)量敲除了乙醛脫氫酶基因。由此可見，敲除消耗底物反應(yīng)的酶編碼基因或消耗NADH反應(yīng)的酶編碼基因都可以增加甘露醇合成。

[1]金紅星,成文玉.明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的研究進(jìn)展[J].中國釀造,2012,(10):4-6.

[2]成文玉,金紅星,金正煥.明串珠菌的碳代謝調(diào)控研究進(jìn)展[J].中國釀造,2012,(06):6-8.