李 柯，陳 丹，李若存，蔣 波，林凡友，王文天

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410013； 2.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102；3.翔宇藥業(yè)股份有限公司，山東 臨沂 276023)

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

復(fù)方益母膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

李 柯1，陳 丹2，李若存1，蔣 波1，林凡友3，王文天3

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410013； 2.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102；3.翔宇藥業(yè)股份有限公司，山東 臨沂 276023)

目的 提高復(fù)方益母膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜（TLC）法對(duì)復(fù)方益母膠囊中益母草進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法進(jìn)行定量分析，色譜柱為Hypersil NH2柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（pH＝5.5)－乙腈(20∶80），檢測(cè)波長(zhǎng)為192 nm。結(jié)果 TLC斑點(diǎn)清晰，分離效果好，陰性對(duì)照無(wú)干擾；鹽酸水蘇堿質(zhì)量濃度在 0.027～0.162 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系較好(r＝0.999 5)，平均回收率為 97.58%，RSD為 2.82%（n＝9）。結(jié)論 所建立的定性、定量分析方法可用于復(fù)方益母膠囊的質(zhì)量控制。

復(fù)方益母膠囊；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；高效液相色譜法；鹽酸水蘇堿

復(fù)方益母膠囊由益母草、當(dāng)歸、川芎、木香4味中藥 組方，活血行氣，化瘀止痛，臨床用于治療氣滯血瘀證所致痛經(jīng)、產(chǎn)后腹痛、產(chǎn)后子宮復(fù)舊等，療效確切[1－3]。為更好地控制本品質(zhì)量，將現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的薄層色譜（TLC）法測(cè)定鹽酸水蘇堿含量改為高效液相色譜（HPLC）法，采用TLC法進(jìn)行木香、益母草定性鑒別，操作簡(jiǎn)單、合理，可作為本品質(zhì)量控制方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Agilent Open LAB色譜數(shù)據(jù)處理軟件。

1.2 試藥

益母草對(duì)照藥材(批號(hào)為120912－201209)，木香對(duì)照藥材（批號(hào)為120921－201309），鹽酸水蘇堿對(duì)照品（批號(hào)為110712－201513），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；復(fù)方益母膠囊（翔宇藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為160102，160107，160313，150505，150517，150609，150713，160101，160112，160203)；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水（實(shí)驗(yàn)室自制），丙酮、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、環(huán)已烷等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 益母草

取3批樣品（批號(hào)分別為160102，160107，160313）內(nèi)容物，研細(xì)，取1 g，分別加乙醇30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過(guò)，濾液濃縮至5 mL，加到中性氧化鋁柱（上海五四化學(xué)試劑，100～200目，5 g，乙醇上柱）上，用50 mL乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓ㄈ葜? mL，作為供試品溶液。另取益母草對(duì)照藥材1 g，加乙醇30 mL，同上述方法制成對(duì)照藥材溶液。再取缺益母草的陰性樣品細(xì)粉1 g，同法制成陰性對(duì)照品溶液。按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502中薄層色譜法[4]試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以丙酮－無(wú)水乙醇－鹽酸（10∶6∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，室溫?fù)]干溶劑，100℃加熱約10 min，取出，放置室溫，噴以新配制的稀碘化鉍鉀與1%三氯化鐵無(wú)水乙醇溶液（2∶1）的混合溶液，至斑點(diǎn)清晰[5]。供試品溶液色譜中，在與益母草對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯橘黃色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品溶液相應(yīng)位置無(wú)斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1 A。

2.1.2 木香

取3批樣品（批號(hào)分別為160102，160107，160313）內(nèi)容物研細(xì)，取1.6 g，分別置帶塞三角瓶中，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)靡掖既芙?，定容? mL，作為供試品溶液。另取木香對(duì)照藥材0.4 g，加20 mL乙酸乙酯，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取缺木香的陰性樣品細(xì)粉1.6 g，同法制成陰性對(duì)照品溶液。照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502中薄層色譜法[4]試驗(yàn)，吸取供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各4 μL，對(duì)照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯（17∶3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，室溫?fù)]干溶劑，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[5]。供試品溶液色譜中，在與木香對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯藍(lán)色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品溶液相應(yīng)位置上無(wú)斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1 B。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（取0.02 mol／L磷酸二氫鈉用0.02 mol／L磷酸氫二鈉調(diào)pH至5.5)－乙腈(20∶80）；檢測(cè)波長(zhǎng)：192 nm；流速：1.0 mL／min；柱溫：30℃。理論板數(shù)按鹽酸水蘇堿峰計(jì)不低于5 000[2]。

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量，75%乙腈溶解，定容，得0.1 g／L的溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取樣品膠囊內(nèi)容物1 g，精密稱(chēng)定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定總質(zhì)量，靜置1 h，于水浴回流（90～100℃）30 min，放置室溫，復(fù)稱(chēng)總質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液10 mL，加到中性氧化鋁柱（100～200目，5 g，內(nèi)徑為1.2 cm）上，用100 mL乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?5%乙腈適量使溶解，定容至10 mL容量瓶中，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[5]。

陰性對(duì)照品溶液：按處方比例和制法制成缺益母草的細(xì)粉，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：精密吸取鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照品溶液在供試品溶液色譜圖上無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.216 g／L）適量，分別加75%乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為 0.027，0.054，0.081，0.108，0.162 g／L的溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，以鹽酸水蘇堿對(duì)照品進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，繪制鹽酸水蘇堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝3 160 X＋7.059，r＝0.999 5（n＝5）。結(jié)果表明，鹽酸水蘇堿質(zhì)量濃度在0.027～0.162 g／L范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為160107，質(zhì)量濃度為3.95 mg／g），加入高、中、低濃度鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量，與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在1.5∶1，1∶1，0.5∶1，依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹽酸水蘇堿加樣回收試驗(yàn)（n＝9）

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為 160107），按低、中、高不同含量樣品取樣，每份樣品分別制備3份，根據(jù)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果供試品中鹽酸水蘇堿平均含量為3.95 mg／g，RSD為2.51%（n＝9），表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為160107），按低、中、高不同含量樣品取樣，每份樣品分別制備 3份，由實(shí)驗(yàn)室不同的操作人員與不同儀器測(cè)定進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果供試品中鹽酸水蘇堿平均含量為3.99 mg／g，RSD為0.71%（n＝9），表明方法中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取放置0，2，4，8，12 h時(shí)的供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定鹽酸水蘇堿的峰面積積分值。結(jié)果的 RSD為1.03%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取10批樣品，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，10批樣品中的鹽酸水蘇堿平均含量為每粒1.91 mg，最低為1.69 mg，考慮到益母草藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、工業(yè)化大生產(chǎn)中有效成分轉(zhuǎn)移率、有效成分穩(wěn)定性等因素對(duì)成品中鹽酸水蘇堿含量的影響，為保證產(chǎn)品在有效期內(nèi)有效成分含量符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，暫訂每粒含益母草以鹽酸水蘇堿（C7H13NO2·HCl）計(jì)，不得少于1.0 mg。

3 討論

3.1 TLC鑒別

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)無(wú)益母草TLC鑒別，本研究中以益母草對(duì)照藥材作對(duì)照，以硅膠G為吸附劑，建立益母草的TLC鑒別方法。經(jīng)耐用性考察方法穩(wěn)定，缺益母草陰性對(duì)照品試驗(yàn)未見(jiàn)干擾?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)木香的TLC展開(kāi)劑為苯－醋酸乙酯（19∶1），因苯毒性較大，長(zhǎng)期使用，會(huì)對(duì)周?chē)h(huán)境及操作人員的身體健康造成傷害。曾選擇不同展開(kāi)劑、不同濃度香草醛硫酸溶液顯色試驗(yàn)，確定以環(huán)己烷－乙酸乙酯（17∶3）為展開(kāi)劑，以5%香草醛硫酸溶液為顯色劑，較2015年版《中國(guó)藥典（一部）》收載的木香TLC鑒別條件[展開(kāi)劑為環(huán)己烷－甲酸乙酯－甲酸（17∶3∶1）]效果更佳[5]。本研究中建立的木香TLC鑒別方法，經(jīng)耐用性試驗(yàn)，斑點(diǎn)清晰，缺木香陰性樣品試驗(yàn)未見(jiàn)干擾?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)改進(jìn)后，處方中的益母草、當(dāng)歸、川芎及木香4味藥材都采用對(duì)照藥材作對(duì)照，全部建立了TLC鑒別方法。

表2 10批樣品含量測(cè)定結(jié)果(n＝2，mg)

3.2 檢測(cè)方法選擇

益母草為方中君藥，鹽酸水蘇堿是益母草主要活性成分，因此將鹽酸水蘇堿作為本品質(zhì)量控制指標(biāo)性成分。目前，測(cè)定益母草及其制劑中鹽酸水蘇堿含量的方法有薄層掃描（TLCS）法，如婦康寧片、加味益母顆粒[6－7]；高效液相色譜－質(zhì)譜（HPLC－MS）法，如婦寧丸、益母草及其顆粒劑[8－9]；高效液相色譜－蒸發(fā)光散射（HPLC－ELXD）法，如益母草膠囊[10]；高效液相色譜－紫外檢測(cè)器（HPLC－UV）法，如益芪顆粒、癃閉舒膠囊、八珍益母片、益母草膏、益母草片、益母草膠囊及益母草顆粒[11－16]。其中HPLC－UV法靈敏度高，重復(fù)性好，易于操作，應(yīng)用廣泛。本品現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)采用TLCS法，在操作過(guò)程中因受各種因素影響，可操作性較差，展開(kāi)劑的比例和展開(kāi)環(huán)境（溫度、濕度）、薄層板固定相的厚度與緊密度、顯色時(shí)所噴顯色劑的量及在薄層板上的均勻度，均會(huì)影響最終測(cè)定結(jié)果，故確定用HPLC法測(cè)定本品中鹽酸水蘇堿的含量。

3.3 色譜柱選擇

2015年版《中國(guó)藥典（一部）》收載品種和文獻(xiàn)報(bào)道中，用HPLC法測(cè)定益母草及其制劑中的鹽酸水蘇堿用強(qiáng)陽(yáng)離子交換（SCX）色譜柱，本研究中在選擇色譜柱時(shí)對(duì)氨基鍵合硅膠與強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基柱的分離效果明顯優(yōu)于陽(yáng)離子交換柱，因此選擇氨基柱作為分離本品的色譜柱。本品益母草采用水提醇沉，當(dāng)歸、川芎及木香用70%乙醇提取制備而成，利用鹽酸水蘇堿易溶于水和乙醇的特性，供試品直接醇提，上氧化鋁柱純化，去除了脂溶性成分的干擾。與薄層色譜法測(cè)定鹽酸水蘇含量比較，本研究中建立的HPLC法具有操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能更好地控制本品質(zhì)量。

[1]林凡友，王世禮.復(fù)方益母膠囊的提取工藝研究[J].齊魯藥事，2012，31（6）：325－326.

[2]張紅蓮.復(fù)方益母膠囊配合暖宮貼促進(jìn)產(chǎn)后子宮復(fù)舊36例觀察[J].河南中醫(yī)，2007，27（9）：52－53.

[3]李振東，劉 俐.復(fù)方益母膠囊治療產(chǎn)后腹痛的臨床分析[J].北方藥學(xué)，2015，12（12）：74－75.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（四部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：57.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1697，290.

[6]王美多，溫 暢.高效薄層色譜法測(cè)定婦康寧片中鹽酸水蘇堿的含量[J].內(nèi)蒙古石油化工，2014(18)：20－21.

[7]侯景英，李志軍，周玉新，等.TLCS測(cè)定加味益母顆粒中鹽酸水蘇堿的含量 [J].中國(guó)醫(yī)藥前沿，2013，8（8）：89－90.

[8]趙 勇，胡娟妮.液－質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定婦寧丸中鹽酸水蘇堿的含量[J].藥物分析雜志，2014，34（2）：345－347.

[9]周 超，張聿梅，何 軼，等.HPLC－MS同時(shí)測(cè)定益母草及其顆粒中鹽酸水蘇堿與鹽酸益母草堿的含量[J].藥物分析雜志，2016，36（5）：830－834.

[10]盛曉靜.HPLC－ELXD法測(cè)定益母草膠囊中鹽酸水蘇堿的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（5）：1183－1185.

[11]汪云偉，鐘 戀，焦小珂，等.HPLC法測(cè)定益芪顆粒中鹽酸水蘇堿的含量[J].中國(guó)藥房，2011，22（16）：1509－1511.

[12]包小紅，周 娟，伍不娥.HPLC法測(cè)定癃閉舒膠囊中鹽酸水蘇堿的含量[J].中成藥，2012，34（9）：1825－1828.

[13]方慧祥，孔艷娥.HPLC法測(cè)定八珍益母片中鹽酸水蘇堿的含量[J].中國(guó)藥房，2014，25（16）：1517－1519.

[14]費(fèi)廣明.HPLC法測(cè)定益芪顆粒中鹽酸水蘇堿的含量[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2014，26（4）：411－413.

[15]包小紅，周 娟，伍不娥.HPLC法測(cè)定4種益母草制劑中鹽酸水蘇堿及其標(biāo)準(zhǔn)方法評(píng)價(jià)[J].中成藥，2012，34（9）：1825－1828.

[16]萬(wàn)斯斯，黃琳瑯.益母草及其制劑中鹽酸水蘇堿含量測(cè)定方法淺析[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用雜志，2010，4（10）：107－108.

Improvement of the Quality Standard of Fufang Yimu Capsule

Li Ke1,Chen Dan2,Li Ruocun1,Jiang Bo1,Lin Fanyou3,Wang Wentian3
(1.Hunan Academy of TCM,Changsha,Hunan,China 410013; 2.Xiangtan Medical and Health Vocational and Technical College,Xiangtan,Hunan, China 411102; 3.Xiangyu Pharmaceutical Limited by Share Ltd.,Linyi,Shangdong,China 276023)

Objective To improve the quality control standard of Fufang Yimu Capsule.M ethods TLC was used for identification of LeonuriHerba in Fufang Yimu Capsule.HPLC was used for quantitative analysis.The Hypersil NH2column(250 mm×4.6 mm，5 m) was used with the mobile phase of mixture of phosphate buffer－acetonitrile(pH＝5.5,20∶80),the detection wavelength was 192 nm.Results TLC sports developed were fairy clear,and the blank test showed no interference.The linear relationship of stachydrine hydrochloride was good in the range of 0.027－0.162 g／L(r＝0.999 5).The average recovery rate was 97.58%,RSD＝2.82%（n＝9）.Conclusion The established qualitative and quantitative analysis method is applicable for the quality control of Fufang Yimu Capsule.

Fufang Yimu Capsule;quality standard;HPLC;stachydrine hydrochloride

R284.1

A

1006－4931(2017)15－0016－04

2017－04－10)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.15.005

李柯，碩士研究生，工程師，研究方向?yàn)橹兴幮滤幑に嚺c質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，（電子信箱）17848689＠qq.com。

陳丹，碩士研究生，講師，研究方向?yàn)樗幬镏苿娫挘?731－88807491（電子信箱）252916321＠qq.com。