畢博文，馮玉慶，梁昭，王政祿（天津市第一中心醫(yī)院生物樣本庫，天津市器官移植臨床醫(yī)學研究中心，天津 300192）

器官移植是現(xiàn)代醫(yī)學的偉大成就，其在治療各種器官終末期疾病方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［1-4］，我國器官移植總數(shù)已躍居世界前列。從提倡“循證醫(yī)學”“轉(zhuǎn)化醫(yī)學”到邁向“整合醫(yī)學”“精準醫(yī)學”，現(xiàn)代醫(yī)學正悄然發(fā)生著顛覆性的變革。豐富而優(yōu)質(zhì)的人體樣本資源，既是生命個體生物信息的載體，又是實施整合和精準診治的物質(zhì)基礎(chǔ)，更是未來生命科學研究的重要保障。移植醫(yī)學作為跨學科交叉性前沿學科，生物樣本彌足珍貴，建設(shè)規(guī)范化、標準化及資源共享的器官移植生物樣本庫是器官移植領(lǐng)域的基礎(chǔ)性工作，將為臨床診治及科學研究提供有力支持和重要保障。

天津市第一中心醫(yī)院建立了我國首家以器官移植為特色的綜合性生物樣本庫，對器官移植相關(guān)生物樣本進行了標準化采集、處理和保存，并制定了器官移植樣本采集流程［5］。本研究主要探討在現(xiàn)有流程下保存的生物樣本能否滿足對分子生物學研究的需要。

1 材料與方法

1.1 一般資料：隨機選取2014年9月-2016年9月生物樣本庫保存的200例惡性腫瘤肝移植患者的組織及血液樣本，包括乙型肝炎肝硬化合并肝細胞癌132例；丙型肝炎肝硬化合并肝細胞癌53例；酒精性肝硬化合并肝細胞癌11例；膽管細胞癌4例。

1.2 主要設(shè)備：液氮存儲罐、冷藏柜、血液分裝工作站、生物安全柜、切片機、組織包埋機、全自動組織脫水機、臺式低溫高速離心機、生物樣本管理系統(tǒng)集、超微量紫外可見分光光度計、生物顯微鏡。

1.3 主要試劑：DNA、RNA提取試劑盒（日本TAKARA試劑盒）、人淋巴細胞分離液、無水乙醇、RNAlater Solution（美國Ambion試劑）、DEPC水等。

1.4 組織樣本采集和保存：手術(shù)醫(yī)生提前1天通知生物樣本庫工作人員手術(shù)安排，與患者簽訂知情同意書并留取術(shù)前血，手術(shù)樣本離體前30分鐘通知樣本庫工作人員進入手術(shù)室。樣本庫人員提前準備樣本采集所需物品，負責樣本采集人員穿戴防護服、無菌手套。樣本離體后護士完成樣本交接，核對樣本數(shù)量及信息后即刻將新鮮樣本轉(zhuǎn)移至樣本采集室。參照相關(guān)文獻制定器官移植樣本采集方法［6-8］，對肝臟進行臟面及膈面拍照存檔，隨后對肝臟進行稱重并測量大小。用無菌取材刀沿肝臟長徑做水平切至腫瘤最大面，采集使用無菌手術(shù)刀在位于腫瘤最遠端部位采集遠瘤樣本，然后再在位于腫瘤邊緣3 cm內(nèi)采集腫瘤旁樣本，隨后采集腫瘤組織（腫瘤大小滿足病理診斷需求，腫瘤直徑≥1 cm，腫瘤診斷的組織體積大于腫瘤的50%），采集時應避免出血和壞死區(qū)域，每塊體積為0.5 m3，放入凍存管內(nèi)，即刻放入液氮轉(zhuǎn)運罐中保存。若肝臟存在多個腫瘤組織，應依照上述流程分別采集和保存，腫瘤間距≤3cm時可共用癌旁組織。提取RNA要求樣本采集器械經(jīng)過DEPC水浸泡4小時以上方可使用［9］，樣本采集后應立即進行RNA提取，隨后置于無菌滅酶的凍存管內(nèi)進入液氮保存。如不能及時提取，也可加入RNAlater置于-20℃保存［10-12］。

1.5 病理對照的采集和處理：所有保存樣本均應與同采集部位取組織一塊，制備石蠟切片用于質(zhì)控檢測并采集鏡下圖像保存。所有樣本采集應避免肉眼所見的壞死、出血、纖維化、鈣化及富含脂肪的部位。制備的石蠟塊與石蠟切片放入常溫蠟塊、切片柜內(nèi)保存。

1.6 體液樣本的采集和保存：留取術(shù)前1天的晨血，術(shù)后血的采集可根據(jù)不同的器官移植并發(fā)癥高發(fā)時間或臨床科研需求制定采血間隔時間［13-14］。血樣采集后即刻分離血清、血漿及血沉棕黃層［15-16］，置于液氮儲存。若患者定期進行隨訪，可采集隨訪當日血液樣本。若進行活檢，則采集當日血液和尿液樣本。

1.7 主要觀察指標：腫瘤樣本采集的準確性及壞死程度，DNA的樣本生物大分子的完整性，降解程度以及電泳條帶清晰程度等。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤組織壞死程度（圖1，圖2）：驗證腫瘤樣本采集部位的準確性，抽取已入庫的200例腫瘤對照石蠟切片進行病理分析，結(jié)果顯示200例樣本中有192例腫瘤面積≥80%。

圖1 肝細胞癌腫瘤組織（HE×4）

圖2 肝細胞癌腫瘤組織（HE×10）

2.2 樣本的核酸檢測結(jié)果：將抽取的樣本進行RNA提取，經(jīng)過紫外分光光度計分析A260/A280均在1.9～2.0，對總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)樣本的完整性較好，受檢的200例樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，RNA的28S及18S色帶均較清晰，28S亮度是18S的2倍，幾乎無拖尾現(xiàn)象，表明RNA的完整性良好（圖3）。同樣提取DNA，利用紫外分光光度計分析A260/A280均在1.8～1.9，利用凝膠電泳實驗檢測樣本DNA完整性，結(jié)果顯示受檢DNA完整性較好，條帶清晰無雜帶拖尾等降解現(xiàn)象（圖4），可以滿足科研實驗需求。以上實驗分析結(jié)果表明，實驗中樣本經(jīng)過規(guī)范化的采集、處理和儲存可獲得較好的質(zhì)量。血液樣本同樣用此類方法進行RNA及DNA的鑒別，結(jié)果合格率分別為90%和92%，基本滿足大多數(shù)科研需求，其中樣本DNA及RNA樣本含量較少的原因考慮為部分移植患者外周血白細胞含量較低。

圖3 凍存的器官移植樣本RNA電泳圖

圖4 凍存的器官移植樣本DNA電泳圖

3 討 論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，轉(zhuǎn)化醫(yī)學的地位日趨重要。倡導實驗研究與臨床應用雙向轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醫(yī)學，其實質(zhì)是理論與實際相結(jié)合、基礎(chǔ)與臨床相整合。這種基礎(chǔ)研究最終轉(zhuǎn)化為臨床應用，需要長時間的驗證，生物樣本的研究就是驗證的最佳手段，樣本的質(zhì)量決定了科研的科學性和準確性，而生物樣本庫作為生物樣本資源采集、儲存及分發(fā)應用的開放性資源共享服務平臺，對于促進醫(yī)療學科建設(shè)和發(fā)展具有重要意義［17-19］。目前，生物樣本庫依據(jù)樣本與信息分類可分為人群隊列生物樣本庫、疾病預防控制中心（center for disease control and prevention， CDC） 生物樣本庫、疾病生物樣本庫和第三方生物樣本儲存中心［20］。器官移植生物樣本庫屬于疾病生物樣本庫，疾病生物樣本庫的特點是其專業(yè)性，根據(jù)臨床疾病特點，采集滿足各類疾病研究相應的生物樣本及其信息資源，有利于?？萍膊【珳梳t(yī)療戰(zhàn)略。肝移植治療肝癌合并肝硬化的療效優(yōu)于手術(shù)切除［21-22］，然而移植術(shù)后肝癌復發(fā)制約了肝移植的發(fā)展，攻克移植后肝癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移難題勢在必行。據(jù)研究表明，人體樣本可以反映人體真實的生物標志物情況，對于現(xiàn)有病情診斷及預后研究都具有重要意義［23-24］，建立規(guī)范化生物樣本庫可以對樣本（配對體液樣本）采集、處理、儲存、臨床資源整合、樣本轉(zhuǎn)運及質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)進行系統(tǒng)化管理，從源頭上保證樣本的高質(zhì)量，實現(xiàn)樣本采集、保存及使用“無縫對接”。

組織樣本進入樣本庫前或短時間內(nèi)，對樣本病理狀況進行評價是保證樣本質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，利用病理技術(shù)對腫瘤占比、壞死程度及細胞結(jié)構(gòu)分析對組織樣本進行質(zhì)量評估，若其中腫瘤成分超過80%則認為質(zhì)量良好，RNA表達的研究往往要求腫瘤組織成分在70%以上，而DNA水平的研究對組織成分要求更高，如腫瘤成分不足65%則應從實驗中剔除。本研究抽取已入庫的200例腫瘤中有192例腫瘤面積≥80%，合格率占96%，說明樣本質(zhì)量較好可以滿足大多數(shù)實驗需求，沒有達到標準的8例是由于術(shù)前抗腫瘤治療導致的腫瘤組織壞死所致，因此，生物樣本庫在采集腫瘤樣本前應提前。

隨著分子生物學研究突飛猛進的發(fā)展，實驗研究對高質(zhì)量腫瘤標本的需求日益增長。降解和被污染的核酸樣本會導致不一致或者不可靠的結(jié)果，因此，規(guī)范化的采集及保存樣本對于樣本核酸產(chǎn)物的質(zhì)量至關(guān)重要。現(xiàn)有的RNA和DNA質(zhì)量評價標準包括RNA濃度、純度及片段完整性的測定，本研究利用紫外分光光度計檢測200例組織樣本的RNA和DNA純度均在標準區(qū)間內(nèi)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析條帶清晰且無雜帶拖尾等現(xiàn)象，說明樣本的RNA、DNA純度及完整性良好。此外，特定的生物分析儀（Agilent2100/4200等）通過整合毛細管電泳和微流體芯片，可快速對RNA樣本的完整性進行評價。

規(guī)范化的生物樣本庫除了儀器設(shè)備、試劑耗材、操作流程及質(zhì)控標準之外還應該建立標準化的倫理審查制度［25］、管理制度和信息化管理才能達到現(xiàn)代化生物樣本庫的標準。優(yōu)質(zhì)的樣本是進行相關(guān)科學研究的保障［26-27］，規(guī)范化建設(shè)器官移植生物樣本庫有利于臨床信息資源的整合和樣本質(zhì)量的保障，促進器官移植領(lǐng)域科研的發(fā)展，具有重要的臨床和科研價值。