畢麗麗，孫玉潔，孔祥瑞，高鈺，馬錫慧，韓永，肖漓，石炳毅（解放軍第三〇九醫(yī)院全軍器官移植研究所，北京市器官移植與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100091）

器官移植的成敗取決于供受者之間的組織相容性，其中人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）等位基因的匹配程度起關(guān)鍵作用［1］。HLA-G作為一種非經(jīng)典的MHCⅠ類分子，通過其受體細(xì)胞內(nèi)的免疫受體酪氨酸抑制性基序（immune receptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM）傳遞抑制性信號(hào)，抑制免疫細(xì)胞的活性，從而實(shí)現(xiàn)免疫耐受［2-3］。HLA-G初始轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接可以產(chǎn)生7種亞型，包括4種膜結(jié)合型（HLA-G1-G4）和3種可溶型（HLA-G5-G7）［4］。HLA-G的主要受 體 有 3種：ILT2/LILRB1/CD85j、ILT4/LILRB2/CD85d和KIR2DL4/CD158d，主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞、自然殺傷（natural kill， NK）細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cells， DC）等免疫細(xì)胞［5］。

HLA-G在介導(dǎo)妊娠免疫、腫瘤免疫、移植免疫過程中，對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)譜均具有重要的調(diào)控作用［6］。Xiao等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在腎移植術(shù)后功能穩(wěn)定組患者血漿中sHLA-G的表達(dá)水平顯著高于急性排斥反應(yīng)（acute reaction， AR）組。Th0細(xì)胞在不同細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下可以分化為Th1、Th2和Th17等多種亞群，它們?cè)诮閷?dǎo)免疫排斥反應(yīng)和免疫耐受平衡中的關(guān)系密切而復(fù)雜［8］。

細(xì)胞因子在介導(dǎo)免疫耐受方面也發(fā)揮著重要作用［9］。CD4+Th細(xì)胞在不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)下可以分化為Th1、Th2、Th17等亞群，Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL-4、IL-10）等與移植免疫耐受密切相關(guān)［4］。腎功能穩(wěn)定組與AR組患者的比較結(jié)果顯示，AR組IL-10含量升高［10］。研究腎移植術(shù)后HLA-G及其受體對(duì)Th2類細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，對(duì)腎移植術(shù)后誘導(dǎo)免疫耐受機(jī)制提供重要的理論依據(jù)和新靶點(diǎn)，為腎移植術(shù)后評(píng)判和治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料：健康供者外周血。大腸桿菌菌株BL21，pET28a質(zhì)粒。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建原核表達(dá)載體：HLA-G基因（編碼區(qū)序列由艾普希隆公司通過化學(xué)方法合成）序列全長1022 bp，編碼區(qū)長1020 bp，共編碼340個(gè)氨基酸。分別在基因序列的5’端和3’端引入限制性內(nèi)切酶Ncol和Xhol的酶切位點(diǎn)識(shí)別序列。將目的基因HLA-G連接到pMD19-T載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，進(jìn)行擴(kuò)增繁殖。用Ncol和Xhol對(duì)pMD19-T-HLA-G和pET28a載體進(jìn)行雙酶切后，將目的基因片段連接到載體DNA上。然后，用插入了HLA-G基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21。

1.2.2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化：挑取平板活化的單菌落，加入10 ml 含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，過夜搖菌；次日早晨按1%轉(zhuǎn)接于50 ml 含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，待其吸光度（A）值為0.5～0.7 時(shí)加入IPTG（0.5 mol/L）誘導(dǎo)；5 000×g離心5分鐘，收集菌體，5 ml PBS平衡緩沖液進(jìn)行懸浮破碎；10 000×g離心20分鐘；沉淀用5 ml PBS重懸；最后將上清液和沉淀進(jìn)行15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）。經(jīng)鎳柱純化，獲得HLA-G1蛋白。

1.2.3 蛋白免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）分析：純化后蛋白先經(jīng)SDS-PAGE，用半干法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜后封閉液室溫封閉1小時(shí)，然后加入小鼠抗HLA-G抗體，4℃旋轉(zhuǎn)震蕩過夜。TBST洗滌3次，每次5分鐘，之后加入辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HPR）標(biāo)記的羊抗小鼠抗體，室溫孵育1小時(shí)。TBST洗滌3次，每次5分鐘，按照顯色底物說明進(jìn)行顯色。

1.2.4 HLA-G1蛋白和外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC）共培養(yǎng)后檢測B細(xì)胞分泌IL-10的表達(dá)：將健康供者的外周血用淋巴細(xì)胞分離液分離出PBMC，將純化的HLA-G1蛋白（分4個(gè)濃度梯度：0、50、100、200 ng/ml）與人PBMC混勻后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育16小時(shí)，通過流式細(xì)胞儀檢測B淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-10的水平。

2 結(jié) 果

2.1 原核表達(dá)載體的鑒定（圖1）：用限制性內(nèi)切酶Ncol和Xhol對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，根據(jù)電泳圖，選擇酶切正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果與GeneBank公布的序列一致。

圖1 pET28a-HLA-G雙酶切電泳圖

2.2 HLA-G1蛋白的表達(dá) （圖2，圖3）：純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定其純度，再經(jīng)Western Blot技術(shù)鑒定蛋白。

2.3 HLA-G1對(duì)B細(xì)胞內(nèi)IL-10表達(dá)的影響（圖4）：將HLA-G1蛋白與人PBMC共培養(yǎng)16小時(shí)后，收集細(xì)胞，CD19 APC標(biāo)記細(xì)胞膜，破膜后，IL-10 PE標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)IL-10，通過流式細(xì)胞儀檢測B淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-10的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著HLA-G1蛋白濃度的增加，B淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-10的表達(dá)水平明顯升高。

圖2 純化后HLA-G1的蛋白（SDS-PAGE）

圖3 純化后的HLA-G1蛋白（Western Blot）

圖4 HLA-G1 4種濃度與PBMC共培養(yǎng)后流式細(xì)胞儀檢測

3 討 論

母體因HLA-G而對(duì)胎兒產(chǎn)生特異性的免疫耐受，提示HLA-G分子可能在腎移植后的免疫耐受中起作用［11］。為研究HLA-G1的功能，本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)表達(dá)HLA-G1蛋白，經(jīng)鎳柱純化得到HLA-G1蛋白，蛋白純度高達(dá)95%以上，以便對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行進(jìn)一步研究。

IL-10作為一種Th2類細(xì)胞因子，通過與受體IL-10R1和IL-10R2結(jié)合，誘導(dǎo)STAT3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，抑制不同靶基因，在誘導(dǎo)免疫耐受方面起重要作用。HLA-G可使Th2類細(xì)胞因子 （IL-10）分泌量上升，使免疫平衡向Th2偏移介導(dǎo)免疫耐受。同時(shí)，IL-10又能上調(diào)HLA-G的表達(dá)，這樣HLA-G與IL-10之間可形成正反饋，造成明顯的Th1/Th2漂移［12］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G誘導(dǎo)的tDC可以分泌高濃度的抑制性細(xì)胞因子IL-10，在DC的免疫調(diào)控中具有重要作用［13-14］。IL-10可以對(duì)Th細(xì)胞亞群進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)：一方面IL-10可以抑制抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell， APC）產(chǎn)生γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和IL-12，抑制巨噬細(xì)胞的活性，從而抑制Th1細(xì)胞的分化，間接促進(jìn)Th2細(xì)胞分化；另一方面，IL-10可以通過抑制B7-2分子的表達(dá)而間接抑制Th2細(xì)胞分化［15］。呂海燕等［13］研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G 可以誘導(dǎo)產(chǎn)生tDC并上調(diào)HLA-G的表達(dá)水平，進(jìn)一步釋放IL-10等抑制性細(xì)胞因子，還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，協(xié)同HLA-G誘導(dǎo)免疫耐受。

本研究中，與4種濃度梯度HLA-G1共同培養(yǎng)的B淋巴細(xì)胞，細(xì)胞因子IL-10的分泌量顯著增加，并且隨著HLA-G1濃度梯度的上升，IL-10的表達(dá)水平也隨之升高。這與前人的研究結(jié)果是一致的［16］。

近年來的研究表明，在外周血及移植物中檢測到HLA-G分子的器官移植患者中，發(fā)生AR的風(fēng)險(xiǎn)更低［17-18］，但研究多集中在HLA-G對(duì)T淋巴細(xì)胞的影響。本研究關(guān)注HLA-G1對(duì)B淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)控作用，希望可以對(duì)腎移植術(shù)后的體液免疫調(diào)控研究提供新思路。同時(shí)，為了更深入的了解HLA-G1的免疫耐受機(jī)制，我們還需要對(duì)更大量樣本進(jìn)行進(jìn)一步探究。