王迪

摘 要：隨著植物轉基因技術的不斷進步，它對于分子遺傳學研究和植物改良都具有特別重要的意義。轉基因植株的篩選在轉基因技術中起著關鍵性的作用。將含有35S啟動子的基因載體PMDC150經(jīng)農桿菌介導，利用農桿菌侵染擬南芥花序的方法轉入擬南芥后得到T1代種子。文章通過組織培養(yǎng)來篩選含有Kan抗性的轉基因植株。

關鍵詞：擬南芥；轉基因植物；篩選

中圖分類號：Q943 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2017）24-0087-02

1 文獻綜述

1.1 轉基因植物的研究進展

植物的遺傳轉化是指利用重組DNA，細胞組織培養(yǎng)等方法，將外源基因導入到植物的組織或細胞中，獲得轉基因植物的技術[1]。從轉基因植株成功之后，轉基因技術飛速發(fā)展，如今，植物在抗病、抗蟲和抗藥等方面都有了轉基因植株。這種技術對改進農作物品質、提高產(chǎn)量等方面都有非常大的幫助。

1.2 基因轉化技術

隨著人們對基因轉化技術不斷地深入研究和探索，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種基因轉化的方法，例如農桿菌介導的基因轉化、花粉管通道法等。相比較其他植物基因的轉化方法，農桿菌介導法有著減少成本、容易操作等優(yōu)點，但對宿主細胞有著嚴格的要求。每種方法都有其優(yōu)缺點，所以根據(jù)植物的不同種類，我們要選擇合理的轉化方法，達到理想的轉化效果。

1.3 本論文的目的和意義

植物的轉基因技術日新月異迅速發(fā)展，已經(jīng)成為許多國家重點發(fā)展的新目標新領域，它所產(chǎn)生的巨大的社會和經(jīng)濟效益促使各個國家對其進行更加深入的研究，由其產(chǎn)生的巨大的生產(chǎn)潛能一定會推動社會的進步，改善人類現(xiàn)有的生產(chǎn)、生活質量以及健康水平。

本文以擬南芥為主要研究對象，通過轉化后的農桿菌侵染擬南芥花序的方法及組織培養(yǎng)的方法進行了轉基因植物的篩選。借由本次實驗研究，可深入了解基因工程等相關領域的理論，可熟練掌握相關技術例如無菌操作技術、植物轉基因技術、植物組織培養(yǎng)技術等等。

2 轉基因植物的篩選與鑒定

2.1 實驗材料

2.1.1 植物材料

擬南芥

2.1.2 載體與菌株

重組表達載體PMDC150-35S（由實驗室提供）、農桿菌菌株GV3101

2.1.3 主要試劑

75%酒精、84消毒液、侵染緩沖液、限制性內切酶、卡那霉素、壯觀霉素（重組表達載體含有的抗性）、利福平

2.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，15g/L瓊脂（只固體培養(yǎng)基添加）

1/2MS培養(yǎng)基

2.2 實驗方法

2.2.1 擬南芥種植：將種子放在浸過水的濾紙上，放在4℃的冰箱中，不見光培養(yǎng)24小時，然后取出種子種在營養(yǎng)土里，在光照強度8000Lux，溫度25℃的培養(yǎng)箱中經(jīng)過光照16小時/黑暗8小時培養(yǎng)[2]。

2.2.2 電轉化將表達載體導入農桿菌

電轉化準備：準備好要轉化的表達載體質粒DNA，將農桿菌細胞處于感受態(tài)，并放在冰上解凍（約3-5min）。

（1）將放有感受態(tài)農桿菌細胞的冰桶轉移到超凈工作臺，用移液器將質粒DNA和農桿菌細胞混合，并用移液器上下吹吸使其混勻。放于冰上3min。（2）將混合液轉移到電轉杯。（3）用電轉電擊3-5s。（4）取出電轉杯，加入800l的LB液體培養(yǎng)基，混勻并轉移至1.5ml的EP管中。（5）放于28℃下，振蕩培養(yǎng)3h。（6）在此期間，配置添加有100g/ml壯觀霉素抗性的LB固體平板，約15min培養(yǎng)基凝固后蓋好蓋，倒置放置。（7）將（5）的懸液離心。取出上上清液，放入800l LB培養(yǎng)基再培養(yǎng)。50min后涂板。（8）取20l LB培養(yǎng)基和30l轉化農桿菌分別先后加入到平板。（9）放于28℃下培養(yǎng)兩天。

2.2.3 質粒提取及鑒定

將以上轉化出的菌斑挑取培養(yǎng)，在28℃下培養(yǎng)24h。

質粒用質粒提取試劑盒提取，并經(jīng)酶切鑒定[3]

酶切體系（20L）：

DdH2O 14.9L

10×buffer 2L

質粒 3L

內切酶 0.1L

（37℃酶切0.5個小時）

2.2.4 農桿菌侵染擬南芥花序

侵染緩沖液的配置：200ml滅菌水、5g蔗糖、40L有機硅：（1）將經(jīng)擴增的陽性菌株離心進行收集，棄去上清液。（2）將收集到的菌株沉淀懸浮于緩沖液中，并使其混合均勻。（3）用移液槍將上述混勻的懸浮液加入到擬南芥的花苞上，避光處理20分鐘，等到菌液快干時再取些懸浮液滴到花苞上，最后將侵染后的擬南芥用保鮮膜包好，放在避光處過夜，次日揭掉保鮮膜，將侵染后的花苞暴露在日光下使其正常生長[2]。（4）培養(yǎng)一段時間后，獲得成熟的擬南芥種子。

2.2.5 組織培養(yǎng)獲得轉基因植株

（1）種子的消毒處理：將擬南芥種子（T1）經(jīng)75%酒精進行表面消毒2分鐘，再用滅菌水清洗2次，然后加入84消毒液、滅菌水、Trition放在搖床上搖30分鐘，最后用滅菌水清洗2-3次。（2）將滅菌后的種子用一定的瓊脂懸浮均勻，用移液槍將懸浮好的擬南芥種子接種于添加50mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，封口膜封好，并做好標記[4]。于4℃冰箱中黑暗處理24h，后置于培養(yǎng)箱，條件為光照16小時/黑暗8小時，光照強度8000Lux，溫度23℃[5]。（3）觀察各種子的生長情況。黃化的子葉逐漸枯萎，綠色的子葉繼續(xù)生長，即為轉化成功。（4）當綠苗長到一定程度后，再移到營養(yǎng)土中培養(yǎng)。

3 結果與分析endprint

3.1 農桿菌的轉化鑒定

對轉化的農桿菌進行鑒定，結果如圖1所示。

BamHI單酶切質粒，所得正確條帶大小為：11000bp，10500bp，1400bp，521bp

第一條：重組表達載體PMDC150-35S，為正確條帶。

第二條：PMDC150酶切對照

第三條：Marker

由轉化鑒定圖可以看出，酶切片段的大小和重組表達載體的大小幾乎一致。結果表明農桿菌轉化成功。

3.2 轉基因擬南芥植株的篩選

對轉基因植株進行篩選，在其他條件都相同的情況下，在分別含有37.5mg/L，40mg/L，50mg/L，60mg/L，70mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)篩選，結果如下表1：

表中數(shù)據(jù)表明，篩選的最適濃度為50mg/L。

因此選用含有50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基來培養(yǎng)植株，成活率最高，且非轉基因幼苗會變黃而逐漸死亡，綠色的轉基因植株得以存活。

4 結論

將含有35S啟動子的基因載體PMDC150轉入農桿菌后，再用轉化后的農桿菌侵染擬南芥花序，培養(yǎng)后得到T1代種子，再用特定培養(yǎng)基篩選出綠色的轉基因擬南芥植株。

由實驗過程可以看出，農桿菌介導法具有較低成本、容易操作而轉化成功率高等優(yōu)點，但卻受宿主細胞基因型的限制[6]。所以，根據(jù)植物的不同種類，我們要選擇合理的轉化方法，以達到理想的轉化效果。

參考文獻：

[1]翟曉巧.泡桐體外植株再生及反義LFY基因遺傳轉化研究[D].東北林業(yè)大學，2004.

[2]渠曉霞.擬南芥糖基轉移酶基因的克隆、載體構建及轉基因植物的研制[D].山東大學，2012.

[3]吳健誼，蔣太峰，許麗艷，等.哺乳動物細胞CDK3系列表達載體的構建與表達[J].汕頭大學醫(yī)學院學報，2010，23（3）：134-137.

[4]王明莉.堿蓬甜菜堿醛脫氫酶基因（ScBADH）的表達分析以及在擬南芥中的功能鑒定[D].吉林農業(yè)大學，2012.

[5]馬新梅.擬南芥細胞分裂素O-糖基轉移酶基因功能分析[D].山東大學，2011.

[6]冉翠香.植物基因工程中目的基因的轉化方法[J].呂梁學院學報，2007，23（1）：3-6.endprint