胡月蓮

(佛山市中醫(yī)院禪城高新區(qū)醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 佛山 528000)

卵泡刺激素對多囊卵巢綜合征患者卵巢顆粒細胞分泌抗苗勒管激素的影響

胡月蓮

(佛山市中醫(yī)院禪城高新區(qū)醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 佛山 528000)

目的 探討卵泡刺激素(FSH)對多囊卵巢綜合征(PCOS)患者卵巢顆粒細胞分泌抗苗勒管激素(AMH)的影響。方法 將60例PCOS患者按隨機數(shù)字表法分為A組和B組，每組30例。2組在月經(jīng)結束后的1周內(nèi)經(jīng)陰道穿刺取竇卵泡，在竇卵泡中將顆粒細胞分離出來。A組的顆粒細胞給予FSH刺激，B組的顆粒細胞不給予FSH刺激。分別檢測2組血清AMH水平、AMH mRNA表達水平及顆粒細胞中AMH啟動子的活性。結果 A組血清AMH水平、AMH mRNA表達水平及顆粒細胞中AMH啟動子活性均明顯高于B組(均P<0.05)。結論AMH是準確評估PCOS患者卵巢儲備功能的指標之一，而FSH用于PCOS能夠抑制患者卵巢顆粒細胞AMH的過度分泌，有效促進卵泡正常發(fā)育。

多囊卵巢綜合征； 卵泡刺激素； 顆粒細胞，卵巢； 抗苗勒管激素

多囊卵巢綜合征(PCOS)是生育年齡婦女常見的一種復雜的內(nèi)分泌及代謝異常所致的疾病，以排卵功能損失或喪失及男性激素產(chǎn)生過剩為主要特征，臨床表現(xiàn)為閉經(jīng)、多毛、肥胖和不孕[1]?？姑缋展芗に?AMH)又稱苗勒管抑制物質(zhì)，是轉(zhuǎn)化生長因子B超家族成員之一。在女性，AMH是由生長卵泡的顆粒細胞分泌，在絕經(jīng)前一直維持可檢測的水平，也具有調(diào)節(jié)生殖細胞發(fā)育和分化的功能[2-3]。近年來，AMH與卵巢功能、PCOS及輔助生殖的關系一直是國內(nèi)外學者關注的熱點問題。本研究探討卵泡刺激素(FSH)對PCOS患者卵巢顆粒細胞分泌AMH的影響，從而明確AMH的臨床意義及FSH對PCOS的治療效果。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2015年7月至2016年11月在佛山市中醫(yī)院禪城高新區(qū)醫(yī)院門診接受治療的PCOS患者60例，均符合PCOS診斷標準[4]。排除由庫欣綜合征、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、雄激素分泌性腫瘤、外源性雄激素應用、21-羥化酶缺乏性非典型腎上腺皮質(zhì)增生等導致的高雄激素血癥的患者。

將60例患者按隨機數(shù)字表法分為2組：A組30例，年齡(28.3±2.7)歲，體質(zhì)指數(shù)(22.1±3.1)kg·m-2，AMH(8±4)μg·L-1，卵泡刺激素(5.4±1.7)U·L-1，促黃體生成素(12±3)U·L-1，催乳素(0.6±0.4)nmol·L-1，雌二醇(136±54)pmol·L-1，睪酮(3.1±0.6)nmol·L-1。B組30例，年齡(27.4±2.1)歲，體質(zhì)指數(shù)(23.4±2.8)kg·m-2，AMH(9±3)μg·L-1，卵泡刺激素(5.1±1.6)U·L-1，促黃體生成素(13±4)U·L-1，催乳素(0.7±0.4)nmol·L-1，雌二醇(138±51)pmol·L-1，睪酮(3.0±0.7)nmol·L-1。

2組年齡、體質(zhì)指數(shù)及AMH、卵泡刺激素、促黃體生成素、催乳素、雌二醇、睪酮水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 顆粒細胞培養(yǎng)

2組在月經(jīng)結束后的1周內(nèi)經(jīng)陰道穿刺取竇卵泡，在竇卵泡中將顆粒細胞分離出來：1)取卵時獲取卵泡液，2000 r·min-1離心10 min，去上清液；2)用磷酸鹽緩沖液(PBS)將沉淀配成懸液，將細胞沉淀懸液以1:1的比例加入淋巴細胞分離液中，2000 r·min-1離心30 min，可見界面處有明顯的顆粒細胞層；3)將顆粒細胞吸取出并置于一新的離心管中，用PBS沖洗2次。1500 r·min-1離心10 min，去上清液，將淋巴細胞分離液洗滌并去除；4)加5 mL PBS洗滌，2000 r·min-1離心5 min，去上清液和剩余的紅細胞；5)加5 mL PBS洗滌，2000 r·min-1離心5 min，去紅細胞裂解液，調(diào)整細胞密度；6)在顆粒細胞中加入M199細胞液(上海經(jīng)科化學科技有限公司)，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司，型號：MCO-18AIC)中培養(yǎng)2～3 d。

1.2.2 FSH刺激方法

A組的顆粒細胞給予FSH刺激，其方法為：在月經(jīng)周期第2天開始注射人基因重組促卵泡激素(r-FSH，Gonal-F75IU/支)，根據(jù)陰道B超監(jiān)測卵泡直徑對Gn劑量進行調(diào)整，直至2～3個卵泡直徑達到16～18 mm。B組的顆粒細胞未給予FSH刺激。

1.2.3 各指標檢測方法

1) 標本采集。2組在自然月經(jīng)周期第3天空腹抽取肘靜脈血3 mL，3000 r·min-1離心5 min，取血清，置-20 ℃ 冰箱保存，待測。

2)檢測方法。①采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測2組血清AMH的水平，ELISA試劑盒購自美國DSL公司，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進行。②使用美國Applied Biosystem公司生產(chǎn)的7500型熒光定量基因擴增儀及trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)檢測AMH mRNA表達的水平，具體操作根據(jù)試劑盒說明書及根據(jù)儀器標準化操作程序進行。AMH mRNA表達水平的計算采用2-△△Ct法。③采用PCR技術提取基因組DNA(DNA大小為3078 bp)，克隆PCR擴增產(chǎn)物至1pMD19-T質(zhì)粒(日本TaKaRa公司)中，并將其克隆至攜帶有螢火蟲熒光酶的PGL3載體(美國Promega公司)中。以PGL3-CON質(zhì)粒作為陽性對照，PGL3空白質(zhì)粒作為陰性對照，檢測擴增的克隆基因中是否含有啟動子的序列。然后，體外培養(yǎng)顆粒細胞1 d。貼壁后，通過脂質(zhì)體lipofectamin2000(美國Invitrogen公司)將攜帶海腎熒光素酶的PRL-TK質(zhì)粒(美國Promega公司)和AMH熒光報告載體轉(zhuǎn)染至顆粒細胞中。48 h后，收集顆粒細胞，并采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)(美國Promega公司)檢測并計算AMH啟動子的活性。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

A組血清AMH水平、AMH mRNA表達水平及顆粒細胞中AMH啟動子活性均明顯高于B組(均P<0.05)，見表1。

組別nAMHρ/(μg·L-1)AMHmRNA顆粒細胞中AMH啟動子活性A組3012.48±2.973.09±1.0712.03±2.15B組307.59±0.881.89±0.617.69±2.57t18.9314.81612.631P<0.05<0.05<0.05

3 討論

PCOS是由生殖內(nèi)分泌和代謝功能異常致排卵障礙性疾病，其發(fā)病率在育齡婦女中高達10%左右[5]。目前，PCOS的病因尚不清楚，其發(fā)病機制及診療方法的研究一直以來都備受學界的關注。AMH是由卵巢竇卵泡的卵巢顆粒細胞分泌的活性因子，其具有調(diào)控卵巢生長、發(fā)育和成熟以及預測卵巢儲備功能的作用，尤其在卵巢儲備功能的評價方面，其可單獨應用或與其他指標聯(lián)合應用，從而有效指導體外受精的治療[6]。AMH也是PCOS診斷的重要指標之一，可反映疾病的嚴重程度。在PCOS患者中，AMH水平升高，患者初級卵泡的生長和分化受到抑制，從而出現(xiàn)排卵；AMH對外周芳香酶活性具有抑制作用，進而導致血液中雄激素水平升高[7]。

本研究通過檢測卵巢顆粒細胞給予FSH刺激(A組)和卵巢顆粒細胞未給予FSH刺激(B組)的血清AMH水平、AMH mRNA表達水平以及顆粒細胞中AMH啟動子的活性，結果發(fā)現(xiàn)，A組血清AMH水平、AMH mRNA表達水平均明顯高于B組(均P<0.05)，提示FSH刺激可抑制PCOS患者卵巢顆粒細胞表達和分泌AMH。本研究結果還發(fā)現(xiàn)，A組顆粒細胞中AMH啟動子活性明顯高于B組(P<0.05)，分析其原因可能是FSH通過對AMH啟動子調(diào)控元件產(chǎn)生作用，從而對AMH mRNA的表達具有抑制作用[8-9]。

綜上所述，AMH是準確評估PCOS患者卵巢儲備功能的指標之一，而FSH用于PCOS能夠抑制患者卵巢顆粒細胞AMH的過度分泌，從而有效促進卵泡正常發(fā)育，有可能成為一種新的治療PCOS的方法。

[1] 盧永軍，阮祥燕，田玄玄，等.多囊卵巢綜合征綜合治療對妊娠結局的影響[J].首都醫(yī)科大學學報，2014，35(4)：428-432.

[2] El Mazny A，Abou Salem N.Anti-Müllerian hormone and antral follicle count for prediction of ovarian stimulation response in polycystic ovary syndrome[J].Gynecol Endocrinol，2013，29(9)：826-829.

[3] Sahmay S，Atakul N，Oncul M，et al.Serum anti-Mullerian hormone levels in the main phenotypes of polycystic ovary syndrome[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2013，170(1)：157-161.

[4] Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group.Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome[J].Fertil Steril，2004，81(1)：19-25.

[5] 張婧，李荔，陳文芬，等.多囊卵巢綜合征發(fā)病機制研究進展[J].實用醫(yī)學雜志，2014，30(2)：323-325.

[6] Lin W Q，Yao L N，Zhang D X，et al.The predictive value of anti-Mullerian hormone on embryo quality，blastocyst development，and pregnancy rate following in vitro fertilization-embryo transfer(IVF-ET)[J].J Assist Reprod Genet，2013，30(5)：649-655.

[7] 李軼，李瑞岐，歐頌邦，等.高雄激素和非高雄激素型多囊卵巢綜合征患者血清抗苗勒管激素分泌特點及診斷效能比較[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2014，30(2)：111-115.

[8] 陳曉，季銀芬，徐鍵.抗苗勒氏管激素(AMH)與多囊卵巢綜合征(PCOS)卵泡發(fā)育異常的關系[J].生殖與避孕，2014，34(5)：383-387.

[9] 徐鑫，李凌云，張靜文，等.兩種卵泡刺激素在多囊卵巢綜合征患者體外受精-胚胎移植中療效比較[J].生殖醫(yī)學雜志，2016，25(4)：305-309.

(責任編輯：胡煒華)

Effect of Follicle Stimulating Hormone on Secretion of Anti-Mullerian Hormone by Granulosa Cells in Patients with Polycystic Ovary Syndrome

HU Yue-lian

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ChanchengHighTechDistrictHospitalofFoshanTraditionalChineseMedicineHospital,Foshan528000,China)

Objective To investigate the effect of follicle stimulating hormone(FSH) on the secretion of anti-Mullerian hormone(AMH) by granulosa cells in patients with polycystic ovary syndrome(PCOS).Methods Sixty patients with PCOS were randomly divided into group A and group B,with 30 patients in each group.Antral follicles were collected by transvaginal puncture within 1 week after the end of menstrual cycle.Granulosa cells were separated from antral follicles,and were stimulated with FSH(group A) or not(group B).Serum AMH level,AMH mRNA expression and AMH promoter activity were detected in both groups.Results Compared with group B,serum AMH level,AMH mRNA expression and AMH promoter activity significantly increased in group A(P<0.05).Conclusion AMH is one of the indicators of ovarian reserve function in patients with PCOS.FSH can inhibit the excessive secretion of AMH in ovarian granulosa cells and promote the normal development of follicles in the treatment of PCOS.

polycystic ovary syndrome; follicle stimulating hormone; granulosa cells,ovary; anti-Mullerian hormone

2017-01-19

佛山市衛(wèi)生和計生局醫(yī)學科研課題立項(20170166)

胡月蓮(1980—)，女，本科，主治醫(yī)師，主要從事婦科疾病的診治研究。

R711； R458

A

1009-8194(2017)07-0045-03

10.13764/j.cnki.lcsy.2017.07.018