陳 娟，孔維宗，梁 凱，王迎春

·實驗性肝炎·

白藜蘆醇對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織SIRT3表達的影響*

陳 娟，孔維宗，梁 凱，王迎春

目的 研究非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝組織沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白3（SIRT3）的表達變化，探討其在NASH發(fā)病中的作用及白藜蘆醇對其的影響。方法 60只SD大鼠被隨機分為正常對照組、NASH模型組和白藜蘆醇處理組，每組20只。采用高脂飼料喂養(yǎng)建立NASH大鼠模型。制備新鮮肝組織勻漿，檢測肝組織內(nèi)活性氧（ROS）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。常規(guī)檢查肝組織病理學變化和超微結(jié)構(gòu)的變化。采用免疫組化法分析SIRT3蛋白的亞細胞定位，采用Western Blot定量檢測SIRT3蛋白的表達。結(jié)果 模型組大鼠肝指數(shù)、血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C含量和氧化應激水平顯著高于對照組（P＜0.01），藥物處理組顯著低于模型組（P＜0.01）；模型組大鼠非酒精性脂肪性肝病活動性評分（NAS）為（6.83±0.41）分，顯著高于對照組[（0.24±0.08）分，P＜0.01]，處理組為（3.27±0.29）分，顯著低于模型組（P＜0.01）；模型組大鼠肝細胞線粒體半定量評分為（3.24±0.21）分，顯著高于對照組[（0.17±0.03）分，P＜0.01]，處理組為（1.39±0.12）分，顯著低于模型組（P＜0.01）；免疫組化檢測顯示SIRT3蛋白在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達，模型組SIRT3蛋白相對表達量為（0.24±0.03），顯著低于對照組[（0.58±0.02），P＜0.01]，而處理組為（0.46±0.03），顯著高于模型組（P＜0.01）。結(jié)論 NASH 大鼠肝組織 SIRT3 表達量下降，白藜蘆醇干預可通過上調(diào)SIRT3的表達改善NASH病理學變化。

非酒精性脂肪性肝炎；SIRT3；白藜蘆醇；大鼠

隨著肥胖癥和2型糖尿病在全球范圍內(nèi)流行，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率亦逐年攀升。有數(shù)據(jù)顯示我國NAFLD患者總數(shù)已超過1億[1]。NAFLD的疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（nonalcoholic simple fatty liver，NAFL）、 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、相關(guān)的肝硬化和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[2，3]。以往的研究表明在診斷為肝硬化和隱源性肝硬化的患者中，50%有NASH背景[4]。沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白3（silent mating type information regulation 2 homolog 3，SIRT3）是定位于線粒體的一種Ⅲ類組蛋白去乙?；?，是第一個被定位于哺乳動物細胞線粒體的乙?；福╯irtuins），并且是唯一個被證明與人類壽命長度相關(guān)的蛋白[5]，是線粒體內(nèi)主要的蛋白去乙?；?，對氧化代謝、氧化應激、細胞凋亡等多種生物活動具有調(diào)節(jié)作用[6-9]。有研究表明，SIRT3與多種肝臟疾病相關(guān)，是NAFLD疾病過程的一個重要的調(diào)控者[10]。白藜蘆醇是SIRT3的激動劑，可使其表達上調(diào)，從而影響脂肪代謝[11]。本研究旨在探討白藜蘆醇對NASH大鼠肝組織SIRT3表達的影響及其對NASH的作用，以及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 雄性SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量160～200 g，購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心；白藜蘆醇購自廣州齊云生物技術(shù)公司；水合氯醛由大連美侖生物技術(shù)有限公司提供；檢測ALT、AST、TG、TC、LDL-C試劑盒（南京建成生物工程研究所）；檢測銅 /鋅 /錳超氧化物歧化酶（Cu/Zn/Mn-superoxide dismutase，CuZn/Mn-SOD）活性試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物-堿性磷酸酶（strept avidin-biotinenzyme complex-alkaline phosphatase，SABC-AP）免疫組化染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗SIRT 3多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Vitros5.1FS自動生化分析儀（美國強生公司）；XD-202生物顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）；IS4000MM小動物活體成像儀【美國Carestream 公司（原Kodak）】。

1.2 NASH大鼠模型的建立 取大鼠60只，適應性喂養(yǎng)1 w。隨機分為對照組、NASH模型組和白藜蘆醇處理組，每組20只。對照組以普通飼料喂養(yǎng)，其余兩組均以高脂飼料喂養(yǎng)。12 w末，每組隨機處死2只大鼠，驗證成模情況。第13 w開始，白藜蘆醇處理組動物每日給予6 mg/ml的白藜蘆醇溶液灌胃，劑量為0.75 ml/100 g；模型組和對照組以0.75 ml/100 g的蒸餾水灌胃。于24 w末，禁食不禁水，次日稱體質(zhì)量后，以10%水合氯醛溶液0.3 m l/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉，固定大鼠，打開腹腔，用真空采血管自下腔靜脈采血，迅速游離并取出肝臟，用預冷生理鹽水沖盡血跡后，稱量肝臟濕質(zhì)量，以計算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。取部分肝組織分別以中性甲醛和戊二醛固定，另取部分肝組織冰浴，用于制備新鮮肝組織勻漿，其余肝組織用液氮快速冷凍后，置于-80℃冰箱保存，以備后續(xù)實驗。

1.3 血生化指標的檢測 使用Vitros5.1FS自動生化分析儀檢測。

1.4 肝組織氧化應激指標的檢測 取少量新鮮肝組織，加入20倍體積的PBS緩沖液冰浴中充分研磨，離心，取上清，BCA法行蛋白定量。按ROS測試試劑盒說明書操作，測定各樣本ROS含量，結(jié)果以熒光強度/mg protein表示；取少量新鮮肝組織，加入10倍體積的PBS緩沖液冰浴中充分勻漿，離心，取上清，蛋白定量后，按Cu/Zn/Mn-SOD活性檢測試劑盒（WST-8法）說明書操作，檢測各樣本SOD活性，結(jié)果以U/mg protein表示。

1.5 肝組織病理學檢查 取中性甲醛固定的肝組織，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。參照Brunt[12]標準進行非酒精性脂肪性肝病活動性評分（nonalcoholic fatty liver disease activityscore，NAS）評分。

1.6 肝組織SIRT3亞細胞定位檢測 采用免疫組化法檢測，取中性甲醛固定的肝組織，石蠟包埋，常規(guī)切片后，按SABC-AP免疫組化染色試劑盒說明書操作，第一抗體為兔抗SIRT 3多克隆抗體（1:50）。在400倍顯微鏡下，在保持暴光條件、暴光時間和光圈恒定的條件下進行照片采集，圖片用IPP6.0軟件進行分析，測定每個視野中陽性反應積分吸光度值（A）及該視野的總面積（M），A/M所得的單位面積積分吸光度值即反映SIRT3蛋白表達量。

1.7 肝組織線粒體結(jié)構(gòu)變化檢查 取戊二醛固定的肝組織，PBS漂洗2次×15 min，1%鋨酸固定2 h，PBS漂洗3次×15 min，梯度序列（50%、70%、80%、90%、100%）乙醇脫水，純環(huán)氧樹脂包埋、切片，枸櫞酸鉛、醋酸雙氧鈾染色各10 min，透射電鏡下觀察。每組大鼠隨機選取3份肝組織樣本，于相同放大倍數(shù)下隨機選5個視野、拍照，每個視野隨機觀察10個肝細胞線粒體。參照Flameng[13]分級法進行肝細胞線粒體半定量評分：0級（0分）：線粒體結(jié)構(gòu)正常，基質(zhì)充滿顆粒；Ⅰ級（1分）：結(jié)構(gòu)基本正常，部分顆粒喪失（輕度腫脹，基質(zhì)密度減少，嵴分離）；Ⅱ級（2分）：線粒體腫脹（基質(zhì)密度明顯降低，嵴分離）；基質(zhì)澄清，嵴尚未斷裂；Ⅲ級（3分）：線粒體嵴斷裂，基質(zhì)凝聚（嚴重腫脹）；Ⅳ級（4分）：內(nèi)外膜完整性破壞，呈空泡狀（嚴重腫脹伴嵴斷裂，內(nèi)外膜破裂）。每個樣本線粒體的平均得分即為該樣本的得分。

1.8 肝組織SIRT3表達檢測 采用Western Blot法，提取肝組織總蛋白，取少量行蛋白定量，取樣品，加上樣緩沖液，煮沸 5 min；取蛋白 10μl，行SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)，350 mA，1h），5%脫脂牛奶封閉液封閉；第一抗體工作液（抗SIRT3抗體1:300，抗Actin抗體1:1000），4℃濕盒孵育過夜；換液漂洗，第二抗體工作液（1:1000）室溫孵育1h，換液漂洗后，ECL顯色液顯色，使用IS4000MM小動物活體成像儀曝光、拍照，應用Quantity One v4.62軟件分析每個條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，各組數(shù)據(jù)間及兩兩比較行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組NASH大鼠肝指數(shù)及血清生化指標變化 模型組大鼠肝指數(shù)和血清生化指標較對照組顯著升高，白藜蘆醇處理組則較模型組明顯下降（P＜0.01，表1），提示白藜蘆醇可明顯改善NAFLD大鼠肝功能及脂質(zhì)代謝。

表1 各組大鼠肝指數(shù)和血清生化指標（±s）比較

表1 各組大鼠肝指數(shù)和血清生化指標（±s）比較

與對照組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

只肝指數(shù)（%）ALT（U/L）AST（U/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）對照組 18 2.5±0.3 46.8±4.3 85.8±7.3 0.3±0.1 0.92±0.2 0.52±0.1模型組 18 3.8±0.4① 85.3±6.7 127.5±9.4 0.8±0.2① 1.51±0.3① 1.72±0.4治療組 18 3.0±0.3② 57.4±4.7② 94.6±8.5② 0.4±0.1② 1.17±0.3② 0.68±0.1

2.2 各組肝組織氧化應激指標的變化 3組大鼠肝組織ROS含量不同，差異有統(tǒng)計學意義（F=548.72，P＜0.01）。模型組肝組織 ROS含量為（407.19±13.68）熒光強度/mg protein，顯著高于對照組[（265.36±9.73）熒光強度 /mg protein，P＜0.01]，白藜蘆醇處理組為（323.62±15.41）熒光強度/mg protein，較模型組降低（P＜0.01）；3組大鼠肝組織SOD的活性不同，差異有統(tǒng)計學意義（F=257.88，P＜0.01）。模型組肝組織SOD活性為（1.67±0.25）U/mg protein，顯著低于對照組 [（3.47±0.20）U/mg

protein，P＜0.01]，白藜蘆醇處理組為（2.54±0.21）U/mg protein，顯著高于模型組（P＜0.01），提示模型組大鼠氧化應激水平明顯升高，白藜蘆醇處理組則顯著降低。

2.3 各組大鼠肝組織病理學改變 在光鏡下，對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，未見脂肪變性及炎癥細胞浸潤；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞內(nèi)可見大量大小不等的脂肪空泡，部分細胞呈氣球樣變性，伴大量炎性細胞浸潤，部分肝細胞碎片狀壞死，少量橋接壞死，匯管區(qū)可見輕、中度炎癥反應；藥物處理組肝細胞脂肪變性、壞死及炎性反應程度均較模型組減輕（圖1）。3組大鼠NAS積分不同，差異有統(tǒng)計學意義（F=2196.45，P＜0.01），模型組肝組織NAS積分為（6.83±0.41）分，顯著高于對照組[（0.24±0.08）分，P＜0.01]，藥物處理組為（3.27±0.29）分，較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠肝組織學變化（HE，100×)

2.4 肝組織SIRT3亞細胞定位變化 在光鏡下，對照組SIRT3蛋白呈強陽性表達，為深棕色顆粒，數(shù)量較多；模型組肝組織SIRT3表達陽性細胞著色較淺，數(shù)量較少；白藜蘆醇處理組SIRT3表達較模型組增多，陽性細胞染色加深。值得一提的是，在各組大鼠肝細胞的細胞核和細胞質(zhì)中均有SIRT3蛋白表達，但對照組以細胞核表達為主，模型組則以細胞質(zhì)表達為主，藥物處理組則細胞核和細胞質(zhì)表達均較多（圖2），提示SIRT3是一種細胞核、細胞質(zhì)均表達的蛋白質(zhì)，并且在應激狀態(tài)下可能存在SIRT3表達從細胞核遷移到細胞質(zhì)的現(xiàn)象。平均積分吸光度半定量分析發(fā)現(xiàn)，3組大鼠SIRT3蛋白表達量不同，差異有統(tǒng)計學意義（F=41.69，P＜0.01），模型組為（19.54±2.53），顯著低于對照組 [（30.21±3.68），P＜0.01]；藥物處理組為（26.75±2.84），顯著高于模型組（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠肝組織SIRT3蛋白表達（免疫組化，400×）

2.5 各組大鼠肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)改變 在電鏡下，對照組大鼠肝細胞內(nèi)線粒體含量豐富，橢圓形，板層嵴；模型組肝細胞線粒體數(shù)量減少，極度腫脹，大部分嵴斷裂甚至消失；白藜蘆醇處理組肝細胞內(nèi)線粒體數(shù)量增多，腫脹明顯減輕，嵴數(shù)量增多（圖3）。3組大鼠肝細胞線粒體Flameng半定量評分結(jié)果不同，差異有統(tǒng)計學意義（F=281.66，P＜0.01）。模型組大鼠肝細胞線粒體得（3.24±0.21）分，顯著高于對照組[（0.17±0.03）分，P＜0.01]，白藜蘆醇處理組得

（1.39±0.12）分，顯著低于模型組（P＜0.01），提示白藜蘆醇能明顯改善線粒體結(jié)構(gòu)損傷。

2.6 各組大鼠肝組織SIRT3蛋白表達量的變化 3組大鼠肝組織SIRT3蛋白表達量不同（圖4），差異有統(tǒng)計學意義（F=336.71，P＜0.01）。模型組大鼠肝組織SIRT3蛋白的相對表達量為（0.24±0.03），顯著低于對照組 [（0.58±0.02），P＜0.01]，藥物處理組為（0.46±0.03），顯著高于模型組（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)的變化（50000×）

圖4 各組大鼠肝組織SIRT3蛋白表達變化（Western Blot）

3 討論

脂質(zhì)沉積，尤其是甘油三酯在肝細胞內(nèi)大量蓄積奠定了NAFLD的發(fā)病基礎(chǔ)。沉默信息調(diào)節(jié)子2（silent information regulator 2，Sir2）蛋白和它在其他原核和真核生物的同源物（sirtuin）均屬Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶。具有高度的NAD+依賴性，其核心區(qū)域具有高度保守的蛋白去乙?；富钚约癆DP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可與多種蛋白相互作用，調(diào)控細胞代謝、應激、衰老、凋亡等過程[14]。哺乳動物sirtuin家族共有7個成員，即SIRT1～SIRT7。其中SIRT3是首個被定位于哺乳動物細胞線粒體的sirtuins，并且是唯一一個被證明與人類壽命長度相關(guān)的蛋白[5]。雖然SIRT4、SIRT5也為線粒體蛋白，但SIRT4只具有ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，SIRT5僅與為數(shù)不多的線粒體蛋白去乙?；顽牾；嘘P(guān)，sirtuins基因敲除實驗證明大部分線粒體蛋白的去乙?；揎検躍IRT3調(diào)控[15]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝指數(shù)、血清生化指標、氧化應激水平、NAS評分、線粒體損傷程度均較對照組增加,并且免疫組化和Western Blot檢測SIRT3表達量明顯下降，而白藜蘆醇處理組反映肝臟功能狀態(tài)的指標均得到改善，氧化應激水平、NAS評分及線粒體損傷均減輕，SIRT3的表達量上調(diào)。一方面說明SIRT3參與NAFLD的病理過程，另一方面說明白藜蘆醇對NASH具有治療作用，這種作用可能是通過其影響SIRT3的表達，從而減輕線粒體的損傷來實現(xiàn)的。

長鏈脂酰輔酶A脫氫酶（long-chain acyl-CoA dehydrogenase，LCAD）是脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵酶，為脂肪酸氧化代謝的第一步。LCAD缺陷可引起脂肪酸氧化作用障礙，使脂肪酸蓄積，TG沉積，引起肝臟脂肪變性及胰島素抵抗[16]。SIRT3可降低LCAD的乙?；剑瑥亩鰪娖浠钚?，敲除SIRT3基因的小鼠脂肪酸氧化水平降低，肝臟中TG、膽固醇酯的含量分別較正常小鼠增加38%和41%，而通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使野生型小鼠過表達SIRT3后，肝臟中的TG含量下降近50%[17]。并且有研究顯示，SIRT3去乙酰化活化LCAD可提高脂肪酸氧化能力，減少TG和脂肪酸氧化中間產(chǎn)物的蓄積，使脂肪肝和肥胖狀態(tài)得到改善[6]。另外，SIRT3還可以激活AMPK蛋白，減少肝細胞中的脂質(zhì)積累[18]，提示SIRT3可通過多條途徑調(diào)節(jié)肝臟脂肪儲蓄量，決定NAFLD的“第一次打擊”的輕重。

根據(jù)SIRT3蛋白片段的大小，可將其分為兩種形式，即44 KD的全長形式和N端被切去142個氨基酸形成的28 KD的短鏈形式。Onyango et al認為短鏈形式的SIRT3主要位于線粒體中，而過度表達的全長形式則分布于細胞基質(zhì)中[19]。Cooper則認為全長形式SIRT3定位于細胞核內(nèi)，但在應激因素的影響下可由細胞核轉(zhuǎn)移至線粒體中，并且認為全長形式的SIRT3蛋白的剪切過程在細胞核中進行，被切掉N末端的短鏈形式則移位至線粒體[20]。然而，Sundaresan et al研究結(jié)果顯示在心肌細胞中全長形式的SIRT3在線粒體、細胞核、細胞基質(zhì)中均有分布，而短鏈形式的SIRT3特異性地分布于線粒體。在面對應激時，細胞基質(zhì)、線粒體、細胞核內(nèi)的SIRT3表達均上調(diào)[21]。我們的研究結(jié)果顯示與之相似，在肝細胞中，SIRT3在細胞質(zhì)和細胞核中都有分布，并且可能存在在應激狀態(tài)下自細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中的現(xiàn)象。高脂飲食小鼠SIRT3蛋白表達量呈現(xiàn)先上調(diào)后下降的的情況[17]。

SIRT3作為機體代謝、應激等多種生理病理的調(diào)控點，其具體的調(diào)控機制已經(jīng)在心血管疾病領(lǐng)域得到廣泛的研究，但其在肝臟疾病的研究才剛剛開始。本研究證實SIRT3參與NAFLD的發(fā)病，白藜蘆醇可能通過上調(diào)SIRT3的表達發(fā)揮改善NASH的作用。另外，本實驗還證實SIRT3在肝細胞細胞核和細胞質(zhì)中均有表達，并且在長期高脂飲食的條件下存在SIRT3表達向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，但是關(guān)于影響SIRT3定位的因素、具體機制及其對細胞將產(chǎn)生何種影響均有待進一步深入研究。

[1] Cohen JC，Horton JD，Hobbs HH.Human fatty liver disease，old questions and new insights.Science，2011，332（6037）:1519-1523.

[2]中華醫(yī)學會.非酒精性脂肪性肝病診療指南.中華肝臟病雜志，2010，18（3）：163-170.

[3] 譚彥芳，趙彩彥.非酒精性脂肪性肝病藥物治療進展.實用肝臟病雜志，2013，16（4）:378-381.

[4] 馬振增，陸倫根.非酒精性脂肪性肝病與肝硬化.實用肝臟病雜志，2016，19（2）：135-138.

[5] Bellizzi D，Dato S，Cavalcante P，et al.Characterization of a bidirectional promoter shared between two human genes related to aging:SIRT3 and PSMD13.Genomics，2007，89（1）:143-150.

[6] Hirschey MD，Shimazu T，Goetzman E，et al.SIRT3 regulates mitochondrial fatty-acid oxidation by reversible enzyme deacetylation.Nature，2010，464（7285）:121-125.

[7] Bause AS，Haigis MC. SIRT3 regulation of mitochondrial oxidative stress.Exp Gerontol，2013，48（7）:634-639.

[8] 尹力，葉雪瑞，劉新新，等.Sirt3對過氧化氫誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的保護作用.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2015，15（31）：6039-6042.

[9] 殷玥 ，李晨，余露，等.有氧間歇訓練抑制高脂喂養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元損傷.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2016，15（3）：213-216.

[10]Cho EH.SIRT3 as a regulator of non-alcoholic fatty liver disease.J Lifestyle Med，2014，4（2）:80-85.

[11]李燕強，華偉娜，楊俊霞，等.白藜蘆醇對肝脂肪積累的抑制作用及其分子機制.中國醫(yī)藥導報，2012，9（33）：9-11.

[12]Kleiner DE，Brunt EM，Van Natta M，et al.Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease.Hepatology，2005，41（6）:1313-1321.

[13]FlamengW，Andres J，F(xiàn)erdinande P，et a1.Mitochondrial function in myocardial stunning.JMol Cell Cardiol，1991，23:1-11．

[14]Michan S，Sinclair D.Sirtuins in mammals:insights into their biological function.Biochem J，2007，404（1）:1-13.

[15]Park J，Chen Y，Tishkoff DX，et al.SIRT5-mediated lysine desuccinylation impacts diverse metabolic pathways.Mol Cell，2013，50（6）:919-930.

[16]Zhang D，Liu ZX，Choi CS，et al.Mitochondrial dysfunction due to long-chain Acyl-CoA dehydrogenase deficiency causes hepatic steatosis and hepatic insulin resistance.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（43）:17075-17080.

[17]Hirschey MD，Shimazu T，Jing E，et al.SIRT3 deficiency and mitochondrial protein hyperacetylation accelerate the development of the metabolic syndrome.Mol Cell，2011，44（2）:177-190.

[18]Shi T，F(xiàn)an GQ，Xiao SD.SIRT3 reduces lipid accumulation via AMPK activation in human hepatic cells.J Dig Dis，2010，11（1）:55-62.

[19]Onyango P，Celic I，McCaffery JM，et al.SIRT3，a human SIR2 homologue，is an NAD-dependent deacetylase localized tomitochondria.Proc Natl Acad Sci U SA，2002，99（21）:13653-13658.

[20]Cooper HM，Spelbrink JN.The human SIRT3 protein deacetylase is exclusively mitochondrial.Biochem J，2008，411（2）:279-285.

[21]Sundaresan NR，Samant SA，Pillai VB，et al.SIRT3 is a stress-responsive deacetylase in cardiomyocytes that protects cells from stress-mediated cell death by deacetylation of Ku70.Mol Cell Biol，2008，28（20）:6384-6401.

（收稿：2016-10-26）

（本文編輯：陳從新）

Im proved expression of SIRT 3 in liver tissues by resveratrol in rats w ith nonalcoholic steatohepatitis

Chen Juan，Kong Weizong，Liang Kai，et al.Department of Gastroenterology，Zhongshan Hospital，Affiliated to Dalian University，Dalian 116001，Liaoning Province，China

Objective To study the expression and effect of silent mating type information regulation 2 homolog 3（SIRT3）in rats with nonalcoholic steatohepatitis（NASH）and evaluate the beneficial intervention of resveratrol on it.M ethods The 60 rats were random ly divided into three groups（20 in each），e.g.normal，NASH and resveratrol-intervened groups.At the end of 24th week，all the rats were sacrificed.Serum biochemical parameters and liver histological ultrastructural characteristics were observed.Reactive oxygen species（ROS）and superoxide dismutase （SOD） in the liver tissues were determined，and SIRT3 protein was assayed by immunohistochemical staining and Western blot.Results The liver index，serum ALT，AST，TG，TC，LDL-C and oxidative stress levels in model rats were significantly higher than those in the normal control（P<0.01），and all those indicators in resveratrol-intervened group showed significantly lower than in the model group（P<0.01）；the nonalcoholic fatty liver disease activity score（NAS）in model group was（6.83±0.41），significantly higher than that in the normal group[（0.24±0.08），P<0.01]，and in the treatment group was（3.27±0.29），significantly lower than in the model group （P<0.01）；the Flameng semiquantitative score of hepatic mitochondria in the model group was（3.24±0.21），significantly higher than that in the normal group[（0.17±0.03），P<0.01]，and in the treatment group was（1.39±0.12），significantly lower than that in the model group （P<0.01）；immunohistochemical staining showed that SIRT3 protein appeared both in the cell nucleus and cytoplasm，and the Western blot quantitative detection of SIRT3 protein showed that it was（0.24±0.03） in the model group，significantly lower than that in the normal group [（0.58 ±0.02），P<0.01]，and in the treatment group was （0.46±0.03），significantly higher than that in the model group （P<0.01）.ConclusionThe SIRT3 expression is decreased in liver tissues of rats with NASH，and resveratrol intervention can improve the expression of the protein，which might alleviate NASH.

Nonalcoholic steatohepatitis；Silent mating type information regulation 2 homolog 3；Resveratrol；Rats

大連市醫(yī)學衛(wèi)生科學研究計劃項目（編號：2016142）

116001遼寧省大連市 大連大學（陳娟，梁凱）；附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科（孔維宗，王迎春）

陳娟，女，27歲，碩士研究生。主要從事非酒精性脂肪性肝病防治研究。E-mail：chj_0130@163.com

王迎春，E-mail:wych_1648@126.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.04.006