方 超， 阮愛東

（1.河海大學(xué)水文水資源學(xué)院， 江蘇 南京 210098；2.水文水資源與水利工程科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210098）

0 引言

煙堿作為煙草中重要的生物堿，俗稱尼古丁，是衡量煙葉品質(zhì)和工業(yè)可用性的關(guān)鍵指標(biāo)[1]，也是煙草工業(yè)廢水和煙草廢棄物的主要有害成分。煙堿具有毒性，低濃度使人興奮，高劑量攝入可造成生物體迅速死亡[2]。目前我國部分煙區(qū)所產(chǎn)煙葉，尤其是上部煙葉煙堿含量偏高[3]。正常情況下煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)烤煙應(yīng)低于3%，白肋煙應(yīng)為2%～4%，而我國烤煙煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為3%～4%，白肋煙達(dá)6%[4]。如何降低煙葉中的煙堿含量到可用范圍內(nèi)，提高煙葉品質(zhì)和工業(yè)可用性，是卷煙行業(yè)亟待解決的熱點(diǎn)課題。

我國是世界上最大的煙草生產(chǎn)國，每年約有近25%的煙葉、煙末等下腳料被廢棄[5]，每千克這些廢棄物中含有約2 000 mg的煙堿[6]。如果對這些高毒性廢棄物不給予合適地處理，它們會逐漸通過 “土壤－水－人體”或“土壤－植物－人體”等途徑，改變土壤結(jié)構(gòu)[7]，污染地下水，間接被人體吸收，嚴(yán)重威脅人群健康和生態(tài)安全[8]。

微生物降解環(huán)境污染物具有高效經(jīng)濟(jì)，不易造成二次污染的優(yōu)點(diǎn)[9]。許多研究表明煙堿可被少數(shù)微生物利用并降解[10-12]。早在1947年ENDERS等[13]就發(fā)現(xiàn)酵母對煙堿存在降解作用，但不能完全降解煙堿。袁勇軍等[14]從福建三明地區(qū)的土壤中篩選到一株中間蒼白桿菌，對質(zhì)量濃度0.5 g/L的煙堿，36 h內(nèi)降解率為97.65%。李曉華等[15]從湖北省襄陽煙草種植地也分離到一株中間蒼白桿菌，煙堿質(zhì)量濃度為1 g/L時，降解率達(dá)88.33%，煙堿質(zhì)量濃度為3 g/L時，菌株生長受到抑制。這些降解菌多數(shù)適應(yīng)煙堿的起始濃度比較低，降解條件不夠?qū)挿?，?shí)際應(yīng)用中，煙堿耐受性強(qiáng)、降解效率高的菌株仍十分匱乏。

以煙堿為唯一碳氮源，分離得到一株煙堿降解菌，完成種屬鑒定和降解性能研究，并對各種培養(yǎng)條件下，菌株代謝煙堿的能力進(jìn)行了檢測分析。旨在豐富煙堿降解的工程菌資源，為微生物在煙草工業(yè)和環(huán)境治理的應(yīng)用建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品采自合肥卷煙廠堆積煙草廢棄物超50 a的土壤。L-nicotine（純度大于99%）購于德國默克化工技術(shù)有限公司。其它化學(xué)試劑均為分析純或色譜純。

培養(yǎng)基情況。①富集培養(yǎng)基成分：K2HPO40.2g/L，KH2PO40.8 g/L，MgSO40.2 g/L，CaSO40.1 g/L，NaMoO40.003 3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，C6H12O61 g/L，煙堿0.5 g/L，pH值=7.0；②無機(jī)鹽選擇培養(yǎng)基（ISM）組成成分：K2HPO40.2g/L，KH2PO40.8g/L，MgSO40.2 g/L，CaSO40.1g/L，NaMoO40.0033g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005g/L，煙堿（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加），pH值=7.0。固體培養(yǎng)時在ISM中加入1.5%～2.0%瓊脂。所有培養(yǎng)基在121℃下高壓蒸汽滅菌25 min。煙堿經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后加入。

1.2 煙堿降解菌的篩選

在100 mL富集培養(yǎng)基中加入2 g樣品土壤，30℃，150 r/min下富集7 d。取培養(yǎng)液至新鮮的ISM（煙堿質(zhì)量濃度1 g/L），相同條件培養(yǎng)7 d，重復(fù)3次。取培養(yǎng)液稀釋涂布在ISM瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h挑取單菌落，劃線在新鮮的ISM瓊脂培養(yǎng)基上，直至獲得純化的菌。

1.3 菌種鑒定

1.3.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[16]《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行。

1.3.2 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

細(xì)菌總DNA用DNA抽提試劑盒提取。使用細(xì)菌通用引物（上海生工公司合成）進(jìn)行PCR反應(yīng)[17]。正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和反向引物：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。 PCR產(chǎn)物的純化和測序由上海生工公司完成。測序結(jié)果利用Blast在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比較和鑒定，并用軟件MEGA 5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 培養(yǎng)條件對菌株生長和降解能力的影響

溫度的影響：將 100 μL 菌液（OD600nm為 0.481）接種到100 mL煙堿質(zhì)量濃度1.5 g/L的ISM中，150 r/min、不同溫度（25，30，35，40 ℃）下培養(yǎng)。

初始pH值的影響：將100 μL菌液 （OD600nm為0.504）接種到100 mL煙堿質(zhì)量濃度1.5 g/L的ISM中，150 r/min、最適溫度、不同 pH 值（5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0）下培養(yǎng)。

初始煙堿濃度的影響：將100 μL菌液（OD600nm為 0.468）接種到 100 mL不同煙堿質(zhì)量濃度（1，2，3，4，5，6，7，8 g/L）的 ISM 中，150 r/min、最適溫度和 pH值下培養(yǎng)。

接種量的影響： 分別將 100，300，900 μL 菌液（OD600nm為0.487）接種到100 mL煙堿質(zhì)量濃度1 g/L的ISM中，150 r/min、最適溫度和pH值下培養(yǎng)。

外加碳源和氮源的影響：將100 μL菌液（OD600nm為0.533）接種到100 mL含不同碳源（葡萄糖質(zhì)量濃度1 g/L，乙醇質(zhì)量濃度1 g/L，乙酸鈉質(zhì)量濃度1 g/L）和含不同氮源（硫酸銨0.002mol/L，硝酸鉀0.004mol/L，亞硝酸鈉0.004 mol/L），及不外加碳氮源的ISM（煙堿質(zhì)量濃度2 g/L）中，150 r/min、最適溫度和pH值下培養(yǎng)24 h。

以上實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個平行。定時檢測菌株生長和煙堿降解情況。

1.5 靜息細(xì)胞對煙堿的降解

取對數(shù)生長期菌液，離心（相對離心力12 000×9.8 m/s2，離心時間 10 min，溫度 4 °C）后用 50 mL 磷酸緩沖液（pH值=7.0）清洗3次，重懸浮于等體積的上述緩沖液，最終OD600nm為0.976。加入質(zhì)量濃度4 g/L的煙堿，150r/min、最適溫度和pH值下培養(yǎng)，定時檢測煙堿的降解。

1.6 分析方法

煙堿的測定：培養(yǎng)物離心（相對離心力12 000×9.8 m/s2，離心時間 10 min，溫度 4 °C）取上清，用高效液相色譜（HPLC，Agilent 1260 Infinity）檢測煙堿濃度。 色譜條件：Ultimate XB-C18（4.6×250mm），流動相為甲醇：0.1%三乙胺（40：60，v/v），流速 1 mL/min，柱溫 35 °C，檢測波長 254 nm，進(jìn)樣量 5 μL。

生物量的測定：培養(yǎng)物離心（相對離心力12 000×9.8m/s2，離心時間 10 min，溫度 4°C）得菌體，用 50mL磷酸緩沖液（pH值=7.0）清洗3次，重懸浮于等體積的上述緩沖液。用紫外分光光度計(jì)測定600 nm處的OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選和鑒定

分離的菌株編號為pRF-1，能以煙堿為唯一碳源、氮源和能源生長。在ISM瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈鈕扣狀，淡黃色，不透明，表面粗糙，中央隆起，邊緣扁平。生理生化鑒定結(jié)果見表1。菌株pRF-1好氧，革蘭氏陰性，氧化酶、接觸酶反應(yīng)陽性，M.R.，V-P反應(yīng)陰性，氧化葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。與惡臭假單胞菌較接近，初步鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）[16]。

表1 菌株pRF-1的生理生化特征

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株pRF-1的16S rDNA序列在GenBank中登錄號為KU363014。利用Blast進(jìn)行序列同源性分析，結(jié)果表明菌株pRF-1與Pseudomonas plecoglossicida的多個菌株同源性均在99%以上，確定菌株pRF-1為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）。該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

2.2 菌株pRF-1的煙堿降解特性

2.2.1 培養(yǎng)溫度對菌株pRF-1生長和降解特性的影響

用煙堿殘余濃度和OD600nm值表示煙堿降解和菌株pRF-1生長情況。

在初始pH值為7.0，煙堿質(zhì)量濃度為1.5 g/L的條件下，菌株pRF-1搖床培養(yǎng)30 h后，在溫度為30℃時，生長量最高，能完全降解加入的煙堿，溫度對菌株生長和煙堿降解的影響見圖2。當(dāng)溫度超過35℃，菌株生長遲緩，煙堿降解率快速下降。大部分假單胞菌屬微生物最適生長溫度在30℃左右[18]，溫度過高，一方面菌株難以生長，一方面酶活性受到抑制，都會制約煙堿的降解。

圖2 溫度對菌株生長和煙堿降解的影響

2.2.2 初始pH對菌株pRF-1生長和降解特性的影響

初始pH值對菌株生長和煙堿降解的影響見圖3。

圖3 初始pH值對菌株生長和煙堿降解的影響

在培養(yǎng)溫度為30℃，煙堿質(zhì)量濃度為1.5 g/L的條件下，初始pH值為6.5～7.5時，菌株pRF-1經(jīng)30 h搖床培養(yǎng)，均能完全降解加入的煙堿，當(dāng)初始pH值為7.0，菌株生長最好。初始pH值小于5.0或大于9.0時，菌株生長明顯受到抑制，煙堿幾乎不降解。與已報(bào)道的Pseudomonassp.HF-1[19]和Pseudomonas stutzeriZCJ[20]相比，菌株pRF-1適應(yīng)初始pH的能力更強(qiáng)，單位時間代謝煙堿的效率更高。

2.2.3 初始煙堿濃度對菌株pRF-1生長和降解特性的影響

在pH值為7.0，培養(yǎng)溫度為30℃條件下，當(dāng)初始煙堿質(zhì)量濃度為1～4 g/L，菌株pRF-1在48 h內(nèi)能完全降解煙堿（見圖4）。

圖4 初始煙堿濃度對菌株生長和煙堿降解的影響

由圖4（a)可以看出，質(zhì)量濃度為5 g/L時，煙堿降解率達(dá)96%。隨初始煙堿質(zhì)量濃度增加，降解率逐漸降低，但高達(dá)8 g/L時，降解率仍有50.72%。說明菌株pRF-1的煙堿耐受力非常高。以前報(bào)道的煙堿降解菌在低濃度煙堿環(huán)境中降解效果較好，但耐受的煙堿質(zhì)量濃度有限，大多數(shù)在6 g/L以內(nèi)，如Pseudomonassp.HF-1[19]，Pseudomonas stutzeriZCJ[20]和Pseudomonas putidaS16[21]的煙堿耐受質(zhì)量濃度分別為2，4.5和6 g/L。本研究篩選的假單胞菌pRF-1在接種量僅為100 μL條件下，48 h內(nèi)對質(zhì)量濃度為8 g/L煙堿的降解率為50.72%，有望應(yīng)用于高濃度煙堿環(huán)境，去除煙堿污染。

由圖4（b）可以看出，煙堿降解和菌株生長均有一段遲緩期，并隨初始煙堿濃度的提高，遲緩期逐漸延長，這一現(xiàn)象也見于其他煙堿降解菌的報(bào)道[19-22]。說明高濃度煙堿對菌株生長存在一定的抑制作用。初始煙堿質(zhì)量濃度為4 g/L，菌株生長量最高。

值得關(guān)注的是，當(dāng)煙堿降解完全后，菌株仍保持較長時間的快速生長，推測菌株pRF-1可以利用煙堿的降解產(chǎn)物。

2.2.4 接種量對煙堿降解的影響

圖5 接種量對煙堿降解的影響

圖6 外加碳源和氮源對煙堿降解的影響

接種量越大，菌株降解煙堿的速率越快（見圖5）。接種量為 900 μL，相比 100 μL，煙堿降解的遲緩期有所縮短。

2.2.5 外加碳源和氮源對煙堿降解的影響

外加碳源和氮源對煙堿降解的影響見圖6。

由圖6可以看出，葡萄糖和乙酸鈉對菌株pRF-1降解煙堿有促進(jìn)作用，乙醇、硫酸銨和亞硝酸鈉對菌株pRF-1降解煙堿有抑制作用，而硝酸鉀則無影響。

2.3 靜息細(xì)胞的煙堿降解性能

靜息細(xì)胞條件下，菌株停止生長，依靠積累的酶來催化降解煙堿。靜息細(xì)胞對煙堿的降解能力見圖7。在含煙堿的磷酸緩沖液中，菌株pRF-1的靜息細(xì)胞在22 h內(nèi)完全降解質(zhì)量濃度為4 g/L煙堿，最大降解效率為每小時降解247 mg的煙堿，說明靜息細(xì)胞內(nèi)存在高效的煙堿降解酶。在醇化煙葉或處理煙草廢棄物時，可以直接通過噴灑事先培養(yǎng)好的菌液，催化降解煙堿，縮短處理時間。

圖7 靜息細(xì)胞對煙堿的降解能力

3 結(jié)論

（1）從堆積煙草廢棄物的土壤中篩選得到一株能以煙堿為唯一碳源、氮源和能源生長的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析，初步鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonassp.），命名為pRF-1。

（2）菌株pRF-1生長和降解煙堿的最適條件均為：溫度30℃，初始pH值為7.0，此條件下，48 h內(nèi)菌株對質(zhì)量濃度為5 g/L的煙堿的降解效率達(dá)96%。菌株pRF-1耐受極高的煙堿濃度，煙堿質(zhì)量濃度達(dá)8 g/L，48 h降解率仍有50.72%。

（3）可通過增大接種量或適當(dāng)外加葡萄糖和乙酸鈉促進(jìn)菌株pRF-1對煙堿的降解效果。

（4）菌株pRF-1的靜息細(xì)胞中存在高效的煙堿降解酶，在22 h內(nèi)完全降解質(zhì)量濃度為4 g/L的煙堿，說明菌株pRF-1可應(yīng)用于煙葉醇化和煙草廢棄物處理。