宋志勇 穆亞敏

（湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102）

某區(qū)居民5-HTTLPR基因多態(tài)性與血糖、三酰甘油、膽固醇的相關(guān)性研究

宋志勇 穆亞敏

（湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102）

目的探討湘潭城區(qū)普通中老年居民5-羥色胺轉(zhuǎn)運體啟動子區(qū)基因多態(tài)性（5-HTTLPR）與血清葡萄糖、膽固醇、三酰甘油的相關(guān)性。方法選取參加健康體檢的湘潭中老年無糖尿病志愿者167例，檢測其空腹血清葡萄糖、三酰甘油及膽固醇水平，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)檢測5-HTTLPR基因多態(tài)性，分析5-HTTLPR基因多態(tài)性與血糖、總膽固醇及三酰甘油之間的相關(guān)性。結(jié)果中老年男性血清葡糖糖濃度在5-HTTLPR基因型SS、SL、LL中有明顯差異（P=0.028＜0.05），用Nemenyi檢驗組間兩兩比較，SS型基因攜帶者的葡萄糖濃度水平比SL型基因攜帶者高（P=0.045）；男性S等位基因攜帶者葡萄糖水平比L等位基因攜帶者高，P=0.011＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論5-HTTLPR基因多態(tài)性與血清葡萄糖存在關(guān)聯(lián)性，而與血清膽固醇及三酰甘油無關(guān)。

糖尿??；5-HTTLPR基因多態(tài)性；血糖；三酰甘油；膽固醇；相關(guān)性

糖尿病是由遺傳、環(huán)境因素的復(fù)合病因引起的以高血糖為特征的慢性代謝性疾病。糖尿病已嚴(yán)重危害我國居民健康。因此糖尿病早前發(fā)現(xiàn)和提前預(yù)防具有非常重要的意義。近年來基因治療以及基因檢測在糖尿病防治中的研究開展如火如荼。有研究表明，5-羥色胺轉(zhuǎn)運體啟動子區(qū)基因（5-HTTLPR）多態(tài)性影響人的血糖控制[1]，可能是2型糖尿病發(fā)病的標(biāo)志[2]。本研究探討湘潭城區(qū)普通中老年人血清葡萄糖、總膽固醇及三酰甘油與5-HTTLPR基因多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象：志愿者來自健康體檢的湘潭市城區(qū)普通中老年人群。年齡50周歲以上漢族，在湘潭居住超過15年以上的中老年人（排除糖尿病，經(jīng)一般調(diào)查確認(rèn)無血緣關(guān)系樣本）。隨機(jī)抽樣167例，其中男性46例，女性121例，同時測定空腹血清葡萄糖、總膽固醇及三酰甘油。

1.2 主要試劑：Taq DNA聚合酶（含buffer）、dNTP購自天根生化科技（北京）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物：5'-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3'；下游引物：5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3'。其他試劑：0.1%BSA（TaKaRa，大連寶生物工程有限公司）、DL2000 DNA Marker（TaKaRa，大連寶生物工程有限公司）、瓊脂糖（上海基因科技股份有限公司）。

表1 5-HTTLPR基因型之間血糖、總膽固醇及三酰甘油濃度的比較（M（QR），mmol/L）

表2 5-HTTLPR等位基因之間血糖、總膽固醇及三酰甘油濃度的比較（M（QR），mmol/L）

1.3 實驗方法

1.3.1 葡聚糖沉淀法從全血白細(xì)胞中提取DNA：抽取志愿者外周靜脈血4 mL（其中3 mL用于DNA模板提取，1 mL用于血清葡萄糖、總膽固醇及三酰甘油測定），置于經(jīng)0.3 M EDTA抗凝處理的試管中，往抗凝血中加入1.5 mL 4%的葡聚糖，混勻靜置45～60 min分層后，取上層淡黃色液體，4 ℃低溫下，2000 r/min，離心10 min。棄上清，往試管中加入1 mL生理鹽水，混勻后2000 r/min，離心5 min，棄上清，加入0.5 mL三蒸水，混勻后2000 r/min離心5 min，棄上清，加0.5 mL TES裂解液，10% SDS液160μL，2 g/L的蛋白酶K 100 μL。37 ℃水浴過夜消化。取出冷卻后，轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，用酚氯仿法抽提模板DNA，-80 ℃保存待用。

1.3.2 DNA基因組純度和濃度測定：用紫外分光光度計測定：取適量的DNA模板，通過OD260的吸光值計算DNA的濃度（OD260/OD280比值在1.7～1.9）。經(jīng)檢測所有模板DNA純度檢測均可，濃度在30～50 ng/μL。

1.3.3 目標(biāo)基因擴(kuò)增：采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）進(jìn)行目標(biāo)基因5-羥色胺轉(zhuǎn)運體啟動子區(qū)基因（5-HTTLPR）擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：DNA模板4 μL（200 ng左右），2×GC buffer 10 μL，上下游引物各2 μL，2mM dNTPs 0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，三蒸水6 μL，總體積為25 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 4 min，10個循環(huán)（95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），20個循環(huán)（95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min 5 s） 72 ℃ 7 min。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物鑒定：1.5%瓊脂糖凝膠電泳（1×TAE buffer配膠，EB染色），75V電壓電泳45 min，圖像分析顯示基因片斷分別為：484bp和528bp?；蚨鄳B(tài)性顯示分別為：SS、SL、LL三種基因型（圖1）。

1.3.4 血清血糖、總膽固醇及三酰甘油濃度的測定：取外周靜脈血1 mL，室溫下靜置半小時。待血清分離后，進(jìn)行葡萄糖（G）、總膽固醇（TCh）以及三酰甘油（TG）水平測定。采用全自動血生化儀測定（湘潭市中心醫(yī)院檢驗科）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SAS V8數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運用卡方，F(xiàn)isher確切概率法對5-HTTLPR基因多態(tài)性進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗。運用非參數(shù)秩和檢驗方法對基因型和等位基因與血生化指標(biāo)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析。以P＜0.05為有顯著差異。

2 結(jié) 果

經(jīng)聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)，目標(biāo)基因擴(kuò)增成功167例，男性46例，女性121例。SS型95例、SL型66例、LL型6例。經(jīng)卡方檢驗， 5-HTTLPR基因型樣本分布符合Hardy-Weinberg平衡。

5-HTTLPR基因型和等位基因與血清葡萄糖、膽固醇及三酰甘油濃度的比較：

2.1 男性：SS型、SL型、LL型攜帶者的葡萄糖非參數(shù)秩和檢驗比較P=0.028＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義，Nemenyi檢驗，兩兩比較得出：SS型基因攜帶者的葡萄糖濃度水平比SL型基因攜帶者高（P=0.045）（表1）。

2.2 男性：S等位基因攜帶者葡萄糖水平比L等位基因攜帶者高，P=0.011＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

3 討 論

目前，有研究表明5-HTTLPR基因多態(tài)性在二型糖尿?。═2DM）的發(fā)病中具有非常密切的聯(lián)系，在T2DM患者中攜帶S等位基因較為多見[3]，在靈長類動物試驗中，有研究顯示攜帶L等位基因的猴子具有明顯的較低血糖水平[4]。本研究通過探討本地區(qū)普通中老年人的血清中葡萄糖、總膽固醇及三酰甘油濃度與5-HTTLPR基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)攜帶S等位基因的普通中老年男性的血糖濃度具有顯著差異，存在關(guān)聯(lián)性，而在中老年女性志愿者中未見明顯差異。表明5-HTTLPR基因中S等位基因攜帶者比L等位基因攜帶者的血糖濃度明顯高些。同時，我們也應(yīng)看到：影響血中葡萄糖代謝的因素很多，涉及基因眾多，下一步我們將加大樣本量進(jìn)行深入研究。

[1] Yamakawa M,Fukushima A,Sakuma K,et al.Serotonin transporter polymorphisms affect human blood glucose control[J]. Biochem Biophys Res Commun,2005,334(4):1165-1171.

[2] Iordanidou M,Petridis I,Tavridou A,et al.The serotonin transporter promoter polymorphism (5-HTTLPR) is associated with type 2 diabetes[J]. Clin Chim Acta,2010,411(3-4):167-171.

[3] 秦永章,榮海欽,季虹,等.5-HTTLPR 基因多態(tài)性與2型糖尿病關(guān)聯(lián)性研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2011,40(7):88-90.

[4] Hoffman JB,Kaplan JR,Kinkead B,et al.Metabolic and reproductive consequences of the serotonin transporter promoter polymorphism (5-HTTLPR) in adult female rhesus monkeys (Ma-caca mulatta)[J].Endocrine,2007,31(2):202-211.

R587.1

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1671-8194（2017）22-0057-02

湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級科研課題立項（編號：ZRKX2017-006）