張志勇 于光屹 陶丹丹 王惠亭 方世宇

（大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116021）

應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

張志勇 于光屹 陶丹丹 王惠亭 方世宇

（大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116021）

目的研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。方法選取36只3～4個(gè)月齡的健康新西蘭兔，分離其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），并在體外進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。將BMSCs與關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)在體外培養(yǎng)瓶中進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)約3 d。將實(shí)驗(yàn)對(duì)象隨機(jī)分為3組，分別進(jìn)行3種不同的處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果移植手術(shù)后12周，移植培養(yǎng)好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)組修復(fù)組織和周圍組織整合良好，且修復(fù)效果顯著優(yōu)于移植單獨(dú)的關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)組和空白對(duì)照組。結(jié)論應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的復(fù)合物能有效的修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)；軟骨缺損；組織工程學(xué)

關(guān)節(jié)軟骨能通過緩解關(guān)節(jié)壓力來維持關(guān)節(jié)的正常功能，在關(guān)節(jié)的活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用[1]。軟骨損傷是一種非常常見的骨科疾病，通常由創(chuàng)傷、腫瘤或感染等原因造成，是臨床治療中一個(gè)非常棘手的問題[2-5]。本研究用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，用關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)作為支架材料，將二者形成的復(fù)合物移植到兔軟骨缺損部位。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取36只3～4個(gè)月齡的健康新西蘭兔，體質(zhì)量約3.0 kg，購(gòu)買自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清、二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)：BMSCs的分離與體外培養(yǎng)采用密度梯度離心法，具體參見穆曉紅等[5]研究方法。

1.4 關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備：關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備主要利用冷凍干燥、化學(xué)去污劑等方法制備脫細(xì)胞的兔關(guān)節(jié)軟骨，具體參見武天佑等[6]文獻(xiàn)中所用方法。

1.5 BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)體外復(fù)合培養(yǎng)：BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)體外復(fù)合培養(yǎng)根據(jù)楊強(qiáng)等[7]研究中所用方法進(jìn)行。

1.6 制備兔軟骨缺損模型：通過耳緣靜脈注射方法麻醉所選取的36只新西蘭兔，用直徑為5 mm的鉆孔儀在兔股骨踝關(guān)節(jié)面鉆2～3 mm深的孔，制備兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。

1.7 實(shí)驗(yàn)分組及移植方法：將所制備的36只軟骨缺損模型的新西蘭兔隨機(jī)分成3組，每組各12只，分別進(jìn)行3種不同的處理：第Ⅰ組兔軟骨缺損部位移植培養(yǎng)好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合物；第Ⅱ組移植單獨(dú)的關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)；第Ⅲ組不做任何移植處理。在手術(shù)后4、8、12周分別處死4只新西蘭兔，取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)組織，然后通過免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行染色，并觀察缺損組織的修復(fù)情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照Sellers關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，并利用SPSS13.0分析各實(shí)驗(yàn)組間是否存在顯著性差異。數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)用新西蘭兔統(tǒng)計(jì)：本研究選取36只3～4個(gè)月齡的健康新西蘭兔，隨機(jī)分為3組，每組12只，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無意外死亡或損失，全部計(jì)入結(jié)果分析。

2.2 體外分離及培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：常規(guī)方法分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并利用免疫染色的方法鑒定了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BMSCs特異性高表達(dá)抗原CD44，而不表達(dá)層粘連蛋白和CD34，表明我們分離機(jī)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是正確的。

2.3 制備關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的支架材料，并研究其特性：Massion染色結(jié)果可見關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)中存在很多的軟骨陷窩且其周圍存在大量的膠原纖維。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞基質(zhì)中沒有殘存的細(xì)胞器或細(xì)胞核，表明脫細(xì)胞基質(zhì)的分離非常干凈。

2.4 觀察并評(píng)估BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的復(fù)合物對(duì)兔軟骨缺損的修復(fù)效果：對(duì)3組新西蘭兔進(jìn)行移植處理后首先觀察其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和健康情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過手術(shù)處理的兔子剛開始很少運(yùn)動(dòng)，但隨著時(shí)間不斷地進(jìn)行自我恢復(fù)后，其運(yùn)動(dòng)情況逐漸恢復(fù)正常，步態(tài)姿勢(shì)正常且術(shù)后2周左右基本恢復(fù)健康。

形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)第Ⅰ組新西蘭兔在移植手術(shù)后，修復(fù)效果較好，對(duì)3組實(shí)驗(yàn)觀察評(píng)分具體結(jié)果見表1。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ組移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的修復(fù)效果與第Ⅱ組單獨(dú)移植關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)和第Ⅲ組不做移植處理的空白組相比都有顯著提高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組術(shù)后12周大體觀察評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果（

表1 各組術(shù)后12周大體觀察評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果（

注：*代表與第Ⅲ組比較P＜0.05，#代表與第Ⅰ組比較P＜0.05

組別表面平整填補(bǔ)缺損深度與正常軟骨組織融合總分Ⅰ0.79±0.32*0.83±0.411.02±0.57*2.63±0.78Ⅱ1.57±0.65*1.71±0.86#1.63±0.45*4.93±1.14#Ⅲ2.45±0.872.48±0.81#2.57±0.827.85±1.23#

3 討 論

組織工程研究的核心內(nèi)容是將細(xì)胞和生物材料通過一定的方法構(gòu)建成具有生命力的活體組織，進(jìn)一步用重新構(gòu)建的具有正常生物功能的活體組織來替換機(jī)體內(nèi)相應(yīng)的受損組織，并通過與周圍的正常組織完整的融合來達(dá)到治療目的，最終維持機(jī)體的正常功能。

本研究應(yīng)用體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)的種子細(xì)胞，用關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)作為支架材料，在體外將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)通過生物醫(yī)學(xué)的方法構(gòu)建成具有生命力的活體組織，進(jìn)而將二者形成的復(fù)合物移植到兔關(guān)節(jié)軟骨的缺損部位并觀察修復(fù)結(jié)果。從組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的角度分別觀察和對(duì)比了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物相比對(duì)照組而言能有效地與周圍組織融合并維持兔軟骨的正常代謝和功能，從而非常有效地修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨的損傷，這表明應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)可以用于修復(fù)兔軟骨損傷。

[1] 徐敬,趙建寧,徐海棟,等.關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)研究進(jìn)展[J].臨床與病理雜志,2015,35(3):455-461.

[2] 阮征,尹慶水,張余.關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)技術(shù)的研究與進(jìn)展[J].中國(guó)組織工程研究,2014(29):4724-4729.

[3] 王巖,李德華.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合多肽凝膠及成軟骨生成因子修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損[J].中國(guó)組織工程研究,2015,19(1):30-36.

[4] 張志勇.轉(zhuǎn)導(dǎo)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生化的研究[D].大連:大連醫(yī)科大學(xué),2009.

[5] 穆曉紅,趙子義,徐林,等.密度梯度離心法體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力[J].中國(guó)組織工程研究,2011,15(27):4955-4958.

[6] 武天佑,夏亞一,王栓科,等.關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞支架材料的制備[J].中國(guó)組織工程研究,2007,11(18):3601-3603.

[7] 楊強(qiáng),彭江,盧世璧,等.軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)多孔支架與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程軟骨的研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2011,91 (17):1161-1166.

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1671-8194（2017）22-0053-02