周麗娜， 王洪新， 梁佩芬， 程 焱

α-硫辛酸對糖調節(jié)受損大鼠認知功能和氧化應激影響的初步研究

周麗娜1， 王洪新1， 梁佩芬1， 程 焱2

目的 研究硫辛酸對糖調節(jié)受損大鼠認知功能和氧化應激的影響。方法 雄性Wistar大鼠隨機分為5組，對照組、模型組、硫辛酸低[15 mg/(kg·d)]、中[30 mg/(kg·d)]、高[60 mg/(kg·d)]劑量組。用高脂高糖飼料飼養(yǎng)法建立糖調節(jié)受損大鼠模型，給予成功的大鼠模型連續(xù)每日灌胃硫辛酸溶液15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg，每日一次，共14 d。用Morris水迷宮法檢測大鼠學習記憶能力；用流式細胞儀檢測各組大鼠海馬組織的ROS含量值。結果 與對照組相比，模型組大鼠學習記憶能力下降(P<0.05)，海馬組織內ROS水平升高(P<0.05)；與模型組相比，硫辛酸組腦內ROS水平下降，大鼠的學習和記憶能力提高，尤以中劑量組改變明顯(P<0.05)。結論 α-硫辛酸對糖調節(jié)受損大鼠的認知功能有保護作用，該保護作用與其抗氧化作用有關。

糖調節(jié)受損； α-硫辛酸； 認知功能； 氧化應激

糖尿病是產生認知障礙的相對獨立而重要的危險因素[1]。而研究表明，氧化應激是引起糖尿病的發(fā)生及發(fā)展的重要因素[2]。糖調節(jié)受損(impaired glucose regulation，IGR)是糖尿病的前期狀態(tài)，目前對于糖調節(jié)受損階段的認知障礙研究仍較少。α-硫辛酸(α-lipoic acid,ALA)是存在于線粒體α-酮酸氧化脫氫酶系中一個重要的輔助因子，作為強而有效的抗氧化劑被廣泛使用，主要通過清除體內的氧自由基和動員機體內源性的抗氧化劑的生成發(fā)揮作用[3]。目前ALA主要應用于糖尿病外周神經病變，并獲得了良好的療效，但ALA能否改善糖調節(jié)受損大鼠的認知功能障礙，相關的臨床報道很少。

本研究建立糖調節(jié)受損大鼠模型，測定其認知功能、氧化應激水平，并研究硫辛酸對認知功能和氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組和模型制備 SPF級Wistar雄性大鼠，體質量180～220 g，由北京維通利華實驗動物有限公司[動物許可證號：SXCK(京)2002-0003]提供。大鼠在標準環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20 ℃～28 ℃，24 h晝夜循環(huán)光照，自由飲水進食。將大鼠隨機分為對照組30只、模型組100只。100只模型組隨機取80只成功模型組再隨機分為模型組和硫辛酸低、中、高劑量干預組，每組20只。故本實驗總共分為5組，對照組20只，模型組20只，硫辛酸低、中、高劑量干預組各20只。對照組給予普通飼料；模型組及硫辛酸組給予高脂高糖飼料。兩組大鼠每日均喂食3次，按每只20 g/日投放飼料，共飼養(yǎng)17 w。第14周進行一次葡萄糖耐量試驗。空腹血糖6.2～7.5 mmol/L或者餐后2 h血糖7.9～10.4 mmol/L為造模成功標準[4]。飼養(yǎng)14 w后，硫辛酸低、中、高劑量組于成功模型大鼠分別連續(xù)每日灌胃硫辛酸溶液15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg，每日一次，共14 d。對照組和模型組每日灌胃蒸餾水。

1.2 行為學檢測 飼養(yǎng)第17 w時，取各組大鼠用Morris水迷宮法[5]進行學習記憶功能測定。先通過4 d的訓練讓大鼠熟悉并游至平臺上。第5天隱藏平臺,通過記錄分析系統(tǒng)分析處理潛伏期,考察學習能力。第6天撤去平臺,進行空間搜索實驗-去除平臺觀察2 min內大鼠在中心區(qū)停留時間百分比和通過原平臺位置次數(shù),測試記憶能力。

1.3 活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)檢測 Morris水迷宮試驗結束后，每組大鼠麻醉后斷頭取腦，冰盤上快速分離海馬，用眼科剪將海馬組織剪碎，輕輕研磨組織后經300目篩網過濾，制備單細胞懸液，然后在室溫下4000 r/min離心3 min，棄上清后加入二氯二氫熒光素-乙酰乙酸醋(2’,7’- dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)工作液，37 ℃避光孵育20 min后應用FACS Aria II流式細胞儀，每個樣本收集104個細胞，以DCF的熒光強度作為ROS含量值。

2 結 果

2.1 糖調節(jié)大鼠成模情況 模型組大鼠14 w時成模率為80%，無死亡大鼠。

2.2 認知功能評定情況 模型組大鼠逃避潛伏期較對照組延長(P<0.05),穿越目標區(qū)次數(shù)較對照組減少(P<0.05)；硫辛酸各干預組大鼠與模型組相比，逃避潛伏期縮短(P<0.05)，穿越目標區(qū)次數(shù)較對照組增加(P<0.05)，尤以中劑量組改變明顯(P<0.05)，結果(見表1)。

2.3 治療前后氧化應激水平比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中ROS增高(P<0.05)，α-硫辛酸各干預組大鼠海馬組織中ROS低于模型組，尤以中劑量組降低明顯(P<0.05)，結果(見表2)。

表1 大鼠學習記憶能力

與正常對照組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；與硫辛酸中劑量組比較△P<0.05

表2 大鼠海馬組織中ROS水平

與正常對照組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；與硫辛酸中劑量組比較△P<0.05

3 討 論

糖調節(jié)受損即糖尿病前期，主要包括空腹血糖受損(impaired fasting glucose，IFG)和糖耐量受損(impaired glucose tolerance，IGT)。糖尿病、高血壓病等血管性因素與認知功能下降及癡呆相關，當患者處于糖尿病前期即糖調節(jié)受損階段時，就已經存在血管病變[6,7]。因此，推測糖尿病前期對認知功能可能有損害，但目前臨床研究較少。本研究通過建立糖調節(jié)受損大鼠模型，通過Morris水迷宮法評價大鼠的認知功能，結果顯示模型組大鼠較對照組大鼠學習記憶能力下降，說明在糖尿病前期即糖調節(jié)受損階段大鼠已出現(xiàn)認知功能損害。

氧化應激是指機體在內外環(huán)境有害刺激的條件下，促氧化與抗氧化之間的平衡失調導致體內活性氧族(reactive oxygen species，ROS)的生成增加和(或)清除ROS的能力降低，ROS所引起的細胞和組織的生理和病理反應。Brownlee[8]曾提出糖尿病血管并發(fā)癥產生的“統(tǒng)一機制”學說，其核心為線粒體電子呼吸鏈中因高血糖誘導產生過量的ROS，引起血管內皮細胞損傷，激活多條糖代謝旁路，最終導致包括糖尿病周圍神經病變、糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病、大血管病變、心肌病等在內的糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生，即氧化應激是高糖損傷共同基礎。既往關于高血糖所致認知障礙及氧化應激水平的研究主要集中在糖尿病形成后[9,10]，糖尿病前期認知障礙與氧化應激水平的相關性研究仍較少。在糖尿病前期階段,由于已存在糖代謝、脂質代謝、胰島素代謝及動脈粥樣硬化的各種病理生理機制異常，我們推測在糖尿病前期可能已經存在認知障礙及氧化應激的異常變化，且三者之間可能存在一定的相關性。本研究結果顯示，糖調節(jié)受損模型大鼠海馬組織內ROS水平升高，表明存在腦組織氧化應激損傷。證實氧化應激在糖調節(jié)受損中起重要作用，為臨床應用抗氧化冶療提供了實驗依據(jù)。

α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,ALA)是1951年由Reed首次從豬肝中分離出來的天然產物[11]，其在體內吸收進入細胞后，可還原成二氫硫辛酸并釋放到細胞外。因此單獨給予α-硫辛酸后，在體內以α-硫辛酸和二氫硫辛酸兩種形式存在，它們協(xié)同作用，共同組成一種“萬能抗氧劑”，有水溶性、脂溶性和分子量小等特點，口服和靜脈途徑給藥都可以良好吸收，可以透過血腦屏障。ALA 是線粒體α-酮酸氧化脫氫酶的一個輔助因子，通過清除體內的氧自由基和動員機體內源性的抗氧化劑如維生素C、維生素E和谷胱甘肽的生成發(fā)揮作用[12]。近幾年主要應用于糖尿病外周神經病變，并獲得了良好的療效，但是否能夠改善糖調節(jié)受損大鼠的認知功能障礙，未見臨床報道。本研究結果顯示，ALA通過抗氧化途徑降低了腦內ROS水平，改善了大鼠的空間學習和記憶能力?？寡趸呗杂锌赡艹蔀橹委熖钦{節(jié)受損中認知功能障礙的新途徑。

綜上所述，本研究通過觀察糖調節(jié)受損大鼠的認知功能和海馬組織的氧化應激水平，為糖調節(jié)受損導致認知障礙的氧化應激機制提供了理論依據(jù)，為血管性認知障礙的治療提供新的途徑。

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A preliminary study of the effects of α-lipoic acid on cognitive function and oxidative stress in rats with impaired glucose regulation

ZHOU Lina,WANG Hongxin，LIANG Peifen，et al.

(Department of Neurology，the Affiliated Fourth Centre Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300140，China)

Objective To study the effects of lipoic acid on cognitive function and oxidative stress in rats with impaired glucose regulation.Methods Male Wistar rats were randomly divided into 5 groups:control group,model group,lipoic acid low 15 mg/(kg/d),medium 30 mg/(kg/d),high 60 mg/(kg/d) dose group.A rat model of impaired glucose regulation was established by feeding with high fat and high sugar diet.The model rats were fed with lipoic acid solution 15,30 and 60 mg/kg daily,1 times daily,with a total of 14 d.The learning and memory abilities of rats were measured by Morris water maze method,and the content of ROS in hippocampus of rats in each group was detected by flow cytometry.Results Compared with the control group,the learning and memory ability of the model group decreased (P<0.05),while the level of ROS in the hippocampus increased (P<0.05).Compared with the model group,the level of ROS in the brain decreased in the lipoic acid group,and the learning and memory ability of the rats increased,especially in the middle dose group (P<0.05).Conclusion Lipoic acid has protective effects on cognitive function in rats with impaired glucose regulation,and its protective effects are related to its antioxidant effects.

Mpaired glucose regulation； α-lipoic acid； Cognitive function； Oxidative stress

2017-04-09；

2017-05-30

(1.天津醫(yī)科大學第四中心臨床學院神經內科，天津 300140;2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經內科，天津 300052)

程 焱，E-mail：cylfl@sohu.com

1003-2754(2017)08-0700-03

R741.05

A