王俊娟，陰祖軍，王德龍，王帥，王曉歌，樊偉麗，郭麗雪，陳超，葉武威

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng)455000）

陸地棉脫水素蛋白GhDHN1的結(jié)構(gòu)特征和無(wú)序性分析

王俊娟，陰祖軍，王德龍，王帥，王曉歌，樊偉麗，郭麗雪，陳超，葉武威*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng)455000）

利用生物信息學(xué)對(duì)陸地棉脫水素蛋白GhDHN1的氨基酸組成理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域K片段以及無(wú)序性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，GhDHN1蛋白無(wú)明顯跨膜結(jié)構(gòu)，不是分泌蛋白，其2個(gè)序列相近的K片段均具有高度親水性，屬于部分無(wú)序性蛋白。推測(cè)GhDHN1的這些結(jié)構(gòu)特性與其調(diào)控棉花響應(yīng)低溫脅迫有關(guān)。

棉花；脫水素蛋白GhDHN1；結(jié)構(gòu)特征；K片段；無(wú)序性

脫水素屬胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白 （Lateembryogenesisabundant protein,LEA）第二家族成員[1]，是植物中廣泛存在的親水性蛋白，與植物抗逆密切相關(guān)[2]。脫水素蛋白具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在非生物逆境下可以穩(wěn)定植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[3]。脫水素的結(jié)構(gòu)是其行使功能的前提條件，脫水素的K片段所形成的雙親性螺旋與部分變性蛋白的疏水位點(diǎn)相結(jié)合，起到類(lèi)似于分子伴侶的作用[4]。筆者團(tuán)隊(duì)在陸地棉（Gossypium hirsutumL.）3葉期的真葉中克隆了棉花脫水素基因GhDHN1，試驗(yàn)結(jié)果顯示，GhDHN1響應(yīng)低溫脅迫，在抗冷材料和冷敏感材料中表達(dá)水平差異顯著，其表達(dá)量與棉花的抗冷性呈正相關(guān)[5]。研究還表明，GhDHN1編碼的蛋白含有211個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為23.79 kD，等電點(diǎn)為5.04；GhDHN1的二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋包含116個(gè)氨基酸殘基，組成該蛋白的主體結(jié)構(gòu)。但GhDHN1蛋白在棉花抗冷中所行使的具體功能尚需進(jìn)一步研究，其蛋白質(zhì)性質(zhì)與其功能的關(guān)系尚不清楚。本研究對(duì)GhDHN1蛋白的結(jié)構(gòu)特性和無(wú)序性進(jìn)行分析，為探索脫水素蛋白GhDHN1的分子功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試數(shù)據(jù)庫(kù)和脫水素蛋白GhDHN1序列的獲取

從已公布的陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[6]（http://cgp.ge

nomics.org.cn/page/species/index.jsp）以及王俊娟等[5]研究結(jié)果獲得所需要的棉花脫水素蛋白GhDHN1序列（序列號(hào)：CotAD_58358）。

1.2 方法

1.2.1 脫水素蛋白GhDHN1跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析。利用在線工具TMHMM Server（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM-2.0）分析GhDHN1的跨膜結(jié)構(gòu)；利用在線工具SignalP Server（http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）分析GhDHN1蛋白質(zhì)N端的信號(hào)肽。

1.2.2 脫水素蛋白GhDHN1核心結(jié)構(gòu)域分析。用在線 Needle軟件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html）將 Close[7]報(bào)道的脫水素結(jié)構(gòu)域序列與GhDHN1蛋白質(zhì)序列進(jìn)行全局比對(duì)，分析GhDHN1保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.3GhDHN1蛋白功能結(jié)構(gòu)示意圖繪制。利用在線功能結(jié)構(gòu)域制圖軟件DOG1.0[8]（http://ibs.biocuckoo.org/online.php）繪制。

1.2.4 脫水素蛋白GhDHN1固有無(wú)序性研究。利用在線工具PONDR○RVL-XT[9]（Predictors of Natural Disordered Regions,http://www.pondr.com/）分析GhDHN1蛋白的固有無(wú)序性。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫水素蛋白GhDHN1跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析

由圖1可以看出，GhDHN1無(wú)明顯跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1A），不屬于跨膜蛋白，這與其具有高度親水性的特性相符合；其N(xiāo)端沒(méi)有信號(hào)肽段（圖1B），說(shuō)明GhDHN1不屬于分泌蛋白。

2.2 脫水素蛋白GhDHN1核心結(jié)構(gòu)域特性分析

K片段是1段由15個(gè)氨基酸殘基組成的富含賴(lài)氨酸的結(jié)構(gòu)域（EKKGIMDKIKEKLPG），是脫水素DHN的特征結(jié)構(gòu)，每個(gè)脫水素蛋白中至少含1個(gè)K片段[10]。通過(guò)對(duì)GhDHN1與NCBI上報(bào)道的脫水素蛋白序列進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)，依據(jù)Close[7]報(bào)道的脫水素結(jié)構(gòu)域序列與GhDHN1蛋白質(zhì)序列進(jìn)行全局序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GhDHN1的N端第81～88個(gè)氨基酸殘基之間含有1個(gè)保守的S片段 （由8個(gè)連續(xù)的絲氨酸組成：SSSSSSSS），C端含有2個(gè)K片段，分別為位于144～158位的EKKGFLEKIKEKLPG和位于185～199的EKKGILEKIKEKLPG，分別記為K1和K2，不含Y片段（圖1），符合SKn類(lèi)型脫水素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[7]。進(jìn)一步分析表明，GhDHN1的K1的氨基酸殘基組成，與大多數(shù)物種脫水素的共有結(jié)構(gòu)K片段（EKKGIMDKIKEKLPG）的相似性為93.3.0%，一致性為80.0%，有3個(gè)氨基酸殘基的差異，而K2的氨基酸殘基組成與后者的相似性為100%，一致性為86.7%，有2個(gè)氨基酸殘基不同。GhDHN1的2個(gè)K片段之間只有1個(gè)氨基酸殘基不同。進(jìn)一步對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，GhDHN1的2個(gè)K片段均富含帶電和極性氨基酸，其中賴(lài)氨酸含量為33.3%，谷氨酸含量為20.0%，甘氨酸含量為13.3%，說(shuō)明GhDHN1蛋白的K片段具有高度親水性，與高粱（Sorghum bicolor）的脫水素蛋白SbDHN1的K片段特性很相似[11]。

圖1 GhDHN1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析示意圖

圖2 GhDHN1蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖

2.3 脫水素蛋白GhDHN1的無(wú)序性分析

通過(guò)無(wú)序性分析軟件PONDR[9]對(duì)GhDHN1蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行無(wú)序性分析，輸出結(jié)果（圖3）顯示GhDHN1是1個(gè)固有無(wú)序性蛋白（Intrinsically disordered protein，IDP）。圖3中縱坐標(biāo)預(yù)測(cè)值大于0.5的認(rèn)為趨于無(wú)序分布，小于0.5趨于有序分布[9]。圖3顯示，GhDHN1的211個(gè)氨基酸殘基中，有109個(gè)是無(wú)序的，占總氨基酸殘基數(shù)的51.66%，含有5個(gè)無(wú)序區(qū)域，分別位于氨基酸殘基1～27，72～113，128～138，164～180和200～211之間，最長(zhǎng)的無(wú)序區(qū)域位于氨基酸殘基72～113之間（圖3中畫(huà)黑粗線的區(qū)域），包含有42個(gè)氨基酸殘基。這些結(jié)果說(shuō)明GhDHN1是1個(gè)部分無(wú)序蛋白。

圖3 脫水素蛋白GhDHN1的PONDR預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

脫水素蛋白是高度親水性蛋白，在植物中響應(yīng)干旱、低溫、鹽等造成的滲透脅迫[12]，其序列富含帶電和極性氨基酸殘基，缺少不帶電荷和非極性氨基酸殘基如色氨酸和半胱氨酸[13]，特別是其保守結(jié)構(gòu)域K片段富含賴(lài)氨酸，可形成α-雙螺旋兩親的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)具有親水性和疏水性的雙重特征[7]，可與膜和蛋白相互作用，在植物遭遇滲透脅迫時(shí)起穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用[14]，而Y片段一般不與膜結(jié)合，與植物的抗冷性關(guān)系不密切[15]。冷脅迫對(duì)植物造成的最大傷害主要是對(duì)細(xì)胞膜的損傷[16-17]，K片段富含帶正電荷的賴(lài)氨酸，與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜脂質(zhì)頭部基團(tuán)相互作用，起穩(wěn)定細(xì)胞膜作用[18]，可使細(xì)胞膜在低溫下保持流動(dòng)性，使其在低溫條件下也能正常發(fā)揮作用[19]。本研究表明GhDHN1含有2個(gè)K片段，不含Y片段，這與筆者團(tuán)隊(duì)前期的研究結(jié)果相一致，即GhDHN1表達(dá)的蛋白可能在細(xì)胞膜附近行使功能，調(diào)控棉花響應(yīng)低溫脅迫[5]，據(jù)推測(cè)，這些功能與其含有2個(gè)K片段的結(jié)構(gòu)具有一定相關(guān)性。

脫水素缺少有序的三級(jí)結(jié)構(gòu)，屬于IDP，可以在水分脅迫過(guò)程中或在低溫條件下阻止蛋白質(zhì)或酶的變性[20-21]，具有IDP性質(zhì)的脫水素會(huì)在清除自由基和結(jié)合金屬離子方面發(fā)揮雙重作用[12,22]。本研究中 PONDR的輸出結(jié)果顯示棉花脫水素GhDHN1屬于部分無(wú)序性蛋白，推測(cè)是由于GhDHN1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的無(wú)序性，使其在低溫脅迫下具有更高的結(jié)構(gòu)彈性和適應(yīng)性，容易與細(xì)胞膜中的酸性磷酸脂特異結(jié)合，對(duì)細(xì)胞膜起保護(hù)作用[23]，從而使GhDHN1的積累與棉花的抗冷性呈正相關(guān)[5]，減輕低溫脅迫對(duì)棉花的傷害。

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The Structure and Disordered Characteristics of GhDHN1 from Upland Cotton

Wang Junjuan,Yin Zujun,Wang Delong,Wang Shuai,Wang Xiaoge,Fan Weili,Guo Lixue,Chen Chao,Ye Wuwei*

Q754：S562.01

A

1000-632X（2017）08-0017-04

10.11963/1000-632X.wjjyww.20170821

2017-04-27 *通信作者：yew158@163.com

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 “七大農(nóng)作物育種”（2016YFD0100203）