吳琳英+鄧順有+王毅飛

【摘要】 目的 探索阿托伐他汀作用于2型糖尿病小鼠對其腸道菌群的影響。方法 20只小鼠隨機按照1∶3分成對照組和模型組， 采用高糖高脂喂食及鏈脲佐菌素腹腔注射的15只成模模型組小鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組、阿托伐他汀組， 每組5只， 二甲雙胍組和阿托伐他汀組各分別給予20 mg/kg和4 mg/kg 20 d灌胃干預(yù)。干預(yù)后收集小鼠血清及新鮮糞便， 血清檢測隨機血糖、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）， C反應(yīng)蛋白（CRP）、內(nèi)毒素（LPS）以及應(yīng)用實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)（qPCR）絕對定量檢測腸道菌群（腸桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌、腸球菌和總菌）數(shù)量。結(jié)果 對照組與模型組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP、LPS比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對照組與二甲雙胍組的TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP、LPS比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對照組與阿托伐他汀組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。二甲雙胍組與阿托伐他汀組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、LPS比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組腸道總菌比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）， 表明各組腸道菌群總量一致。與對照組比較， 模型組2型糖尿病腸道菌群中腸桿菌、腸球菌增加， 乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌減少， 且干預(yù)后具體菌屬改變主要表現(xiàn)為：二甲雙胍組和阿托伐他汀組腸桿菌和腸球菌均減少， 乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌增加（P<0.05）；而二甲雙胍組較阿托伐他汀組更加能提高雙歧桿菌和擬桿菌的數(shù)量（P<0.05）， 阿托伐他汀組較二甲雙胍組更加能減少腸桿菌、腸球菌和提高乳桿菌的數(shù)量（P<0.05）。結(jié)論 阿托伐他汀可以通過減少腸桿菌和腸球菌致病菌和增加乳桿菌益生菌以及減少其代謝產(chǎn)物LPS來調(diào)節(jié)2型糖尿病腸道菌群， 其可能是他汀降脂藥作用于2型糖尿病的機制之一。

【關(guān)鍵詞】 2型糖尿??；阿托伐他??；腸道菌群；炎癥

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.22.074

肥胖、身體脂肪過多等不良生活習慣是導(dǎo)致2型糖尿病的主要因素， 2型糖尿病主要表現(xiàn)為胰島素抵抗或胰島素相對不足， 胰島素參與脂質(zhì)調(diào)控。血脂高常伴隨2型糖尿病發(fā)生， 是慢性代謝綜合征疾病中的主要組成部分， 已成為威脅全世界人民健康的主要問題。2型糖尿病常伴著高脂血癥會增加心血管及腎臟等并發(fā)癥的發(fā)生， 甚至明顯增加死亡率， 因此如何從改善高脂血癥防治2型糖尿病成為現(xiàn)在糖尿病研究領(lǐng)域的重點問題[1]。目前很多研究發(fā)現(xiàn)糖尿病和肥胖的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群密切相關(guān)， 機制可能與腸道菌群及其代謝產(chǎn)物LPS參與了胰島素抵抗、糖尿病慢性炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血糖血脂代謝、免疫等相關(guān)[2]。因此， 從腸道菌群角度去探索如何防治2型糖尿病已成為目前研究的熱點。目前最主要的降脂藥他汀類藥物能有效延緩冠狀動脈粥樣硬化等心腦血管病變， 且已成為治療2型糖尿病的二線藥物。但目前并不清楚其是否能影響2型糖尿病的腸道菌群從而改善糖尿病。本研究通過使用阿托伐他汀干預(yù)2型糖尿病小鼠以探索其對2型糖尿病的腸道菌群的影響， 從而為降脂類藥物更好地用于防治2型糖尿病提供新的思路。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 SPF級雄性昆明小鼠20只， 體重（20±2）g， 由廣東省動物中心提供， 先在檢疫室檢疫7 d后轉(zhuǎn)入SPF級動物房。

1. 2 主要試劑 高糖高脂小鼠飼料由廣東省動物中心訂做（廣州）， 鏈脲佐菌素（STZ）購于sigma公司（美國）， 鹽酸二甲雙胍片購于中美上海施貴寶制藥公司， 阿托伐他汀片購于輝瑞公司（美國）， TC、TG、LDL-C、HDL-C、CRP的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購于武漢華美生物公司， LPS檢測試劑盒購于上海榕柏生物技術(shù)公司， 糞便DNA提取試劑盒購于北京天根生化科技公司， 腸道菌群qPCR試劑盒iQtm SYBR Green SuperMix（BioRad公司， 美國）， 血糖儀和血糖試紙條購于強生公司（美國）。

1. 3 實驗方法

1. 3. 1 2型糖尿病小鼠模型建立 2型糖尿病小鼠模型建立參照沈亞非等[3]的方法：20只小鼠隨機按照1∶3分成對照組和模型組。模型組每天給予高糖高脂飲食及飲水， 連續(xù)給予30 d， 且每隔2天腹腔注射無菌的1% 鏈脲佐霉素（40 mg/kg）至30 d， 斷尾取血檢測其隨機血糖≥15 mmol/L即造模成功；對照組每天給予正常飲食飲水， 且每隔2天腹腔注射等量的無菌水至30 d， 斷尾取血檢測其隨機血糖。

1. 3. 2 干預(yù)及標本留取 15只成模模型組小鼠隨機分為三組：模型組、二甲雙胍組、阿托伐他汀組， 每組5只， 均正常飲食飲水。模型組不給予干預(yù)， 二甲雙胍組給予二甲雙胍20 mg/kg灌胃， 阿托伐他汀組給予阿托伐他汀4 mg/kg灌胃， 均干預(yù)20 d后留取小鼠新鮮糞便、血清置于-80℃低溫冰箱儲存。

1. 3. 3 血糖血脂及炎癥檢測 血糖采用血糖儀及試紙進行隨機血糖檢測， 血脂指標（TC、TG、LDL-C、HDL-C）使用血清在全自動生化儀檢測得到， 炎癥指標（CRP）使用血清采用ELISA法嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測， LPS采用終點顯色鱟試劑法嚴格按照其試劑盒說明書進行。

1. 3. 4 腸道菌群qPCR絕對定量 各腸道菌引物參考相關(guān)文獻使用各菌屬通用16S rDNA進行設(shè)計且在NCBI BLAST驗證可用， 引物序列參考文獻[4]， 由華大基因公司合成引物序列及合成各細菌基因標準品。各菌標準品原液測定其DNA濃度按濃度依次10倍稀釋8個梯度待用， 各樣本糞便DNA提取嚴格按照試劑盒說明書進行， 紫外分光光度計測定DNA濃度及純度， 再將各樣本DNA稀釋到相同濃度備用。qPCR絕對定量采用20 μl反應(yīng)體系：樣本DNA模板/標準品DNA模板1 μl， 上、下游引物各1 μl， 滅菌蒸餾水7 μl， SYBR Green SuperMix 10 μl， 稍震蕩混勻且稍離心后進行熒光定量PCR程序。qPCR擴增條件為：95℃預(yù)變性5 min， 58℃15 s， 72℃30 s， 進行40個循環(huán)， 每個樣本重復(fù)檢測3次。數(shù)據(jù)由熒光PCR儀自帶軟件分析完成， 根據(jù)標準曲線計算擴增效率E在90%～105%， 且根據(jù)標準曲線線性方程得到各樣本的拷貝數(shù)。endprint

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 血糖血脂及炎癥情況 對照組與模型組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP、LPS比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對照組與二甲雙胍組的TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP、LPS比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對照組與阿托伐他汀組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、體重、CRP比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。二甲雙胍組與阿托伐他汀組的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、LPS比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 腸道菌群變化 各組腸道總菌比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）， 表明各組腸道菌群總量一致。與對照組比較， 模型組2型糖尿病腸道菌群中腸桿菌、腸球菌增加， 乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌減少， 且干預(yù)后具體菌屬改變主要表現(xiàn)為：二甲雙胍組和阿托伐他汀組腸桿菌和腸球菌均減少， 乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌增加（P<0.05）；而二甲雙胍組較阿托伐他汀組更加能提高雙歧桿菌和擬桿菌的數(shù)量（P<0.05）， 阿托伐他汀組較二甲雙胍組更加能減少腸桿菌、腸球菌和提高乳桿菌的數(shù)量（P<0.05）。見表2。

3 討論

人體的腸道菌群包括了10～100萬億個微生物， 1千多種不同的菌屬， 是人體所有細胞總數(shù)的10倍[5]。腸道菌群在人體的新陳代謝、營養(yǎng)、能量、免疫等功能方面都起著非常重要的作用， 是人體最大的器官[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)很多疾病都與腸道菌群相關(guān)[6]。2型糖尿病是目前全世界最廣泛的慢性代謝性疾病， 其發(fā)病率日益增長[7]。我國2型糖尿病的發(fā)病率為11.6%， 也在迅速增加[8]。Larsen 等[9]通過使用16S rDNA測序和熒光定量PCR方法發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腸道菌群總數(shù)不發(fā)生改變， 其多樣性發(fā)生改變， 主要是腸道益生菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量下降， 變形菌門明顯增多， 劉海霞等[10]采用qPCR檢測2型糖尿病患者糞便發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌減少， 糞腸球菌增加。作者的研究也顯示2型糖尿病腸道菌群總體不變， 會出現(xiàn)雙歧桿菌、乳桿菌的減少以及屬于變形菌門的腸桿菌、腸球菌增加相一致的結(jié)果。

近年研究發(fā)現(xiàn)， 肥胖及相關(guān)代謝性疾病如糖尿病患者血清等都存在LPS、CRP、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的升高， 慢性低度炎癥反應(yīng)一直伴隨疾病始終[11]。LPS是腸道菌群中革蘭陰性菌細胞壁成分的脂多糖， 是腸道菌群， 代謝產(chǎn)物， 其參與糖尿病等代謝疾病的腸道炎癥反應(yīng)， 且可誘導(dǎo)慢性系統(tǒng)炎癥， 從而導(dǎo)致以及加速糖尿病等代謝性疾病發(fā)生發(fā)展[12]。Cani等[13]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可以改善高脂肪因素的2型糖尿病小鼠胰島素抵抗情況， 且也可以降低LPS等炎癥因子， 改善腸道黏膜屏障， 可見腸道菌群已成為防治糖尿病的新靶點。本研究發(fā)現(xiàn)主要的降糖藥物二甲雙胍和降脂藥物阿托伐他汀均可降低糖尿病炎癥因子LPS和CRP， 且阿托伐他汀的降低LPS效果更佳。

二甲雙胍是臨床最主要廣泛的降糖藥， 為糖尿病治療的一線用藥， 其可以通過抑制肝糖原異生， 增加外周組織利用葡萄糖， 抑制腸壁細胞攝取葡萄糖， 減少胰島素抵抗， 增加胰島素敏感性， 從而降低血糖。目前研究已顯示其可以調(diào)節(jié)腸道菌群， Shin 等[14]研究發(fā)現(xiàn)， 高脂飲食喂養(yǎng)的糖尿病小鼠給予二甲雙胍治療后腸道內(nèi)粘液素降解菌Akkermansia明顯增多， 表明腸道菌群可能與二甲雙胍降糖機制相關(guān)。Forslund等[15]研究也發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對2型糖尿病患者腸道菌群有影響， 主要會顯著增加腸桿菌， intestinibacter屬顯著降低， 且不同國家2型糖尿病患者腸道菌群影響不同。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍會減少2型糖尿病小鼠腸桿菌數(shù)量， 其可能跟種屬不同相關(guān)。阿托伐他汀是他汀類降脂藥的代表藥物， 其具有很強的降脂作用， 卻會產(chǎn)生血糖升高等副作用， 但是降脂也是防治糖尿病等代謝性疾病的重要環(huán)節(jié)， 且目前研究大多顯示腸道菌群與脂質(zhì)代謝緊密相關(guān)[16]。所以作者的研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以增加益生菌乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌， 減少腸桿菌及腸球菌致病菌， 且其增加乳桿菌， 減少腸桿菌和腸球菌效果明顯優(yōu)于二甲雙胍?？梢姲⑼蟹ニ≡诮抵耐瑫r可能主要是通過調(diào)節(jié)增加乳桿菌多產(chǎn)生丁酸鹽等短鏈脂肪酸從而抑制致病菌腸桿菌和腸球菌的生長， 減少其代謝產(chǎn)物LPS的產(chǎn)生， 最終達到降低炎癥反應(yīng)的作用， 從而發(fā)揮降脂作用， 改善糖尿病。

綜上所述， 阿托伐他汀可以通過減少腸桿菌和腸球菌致病菌和增加乳桿菌益生菌以及減少其代謝產(chǎn)物LPS來調(diào)節(jié)2型糖尿病腸道菌群， 其可能是他汀降脂藥作用于2型糖尿病的機制之一。且阿托伐他汀與二甲雙胍在對糖尿病腸道菌群影響方面各有側(cè)重點， 將來進一步研究兩者在糖尿病腸道菌群的不同作用， 可以發(fā)揮兩種藥的協(xié)同作用， 更有利于防治2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

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[收稿日期：2017-04-18]endprint