盧穗萬(wàn)+曾文龍+闕敢波+簡(jiǎn)以增+余強(qiáng)鋒+張洪彬+黃騰欽+潘偉華+陳煌祥

[摘要] 目的 探討核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB在肝癌中的表達(dá)情況及其與肝癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的關(guān)系。方法 （1）方便收集福建省龍巖市第二醫(yī)院2014年12月—2015年10月肝癌患者12例外周血樣本，采用CanPatrol CTC二代富集技術(shù)分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）；②采用RNA原位雜交（RNA-ISH）技術(shù)，鑒定CTCs類型和檢測(cè)NF-kB的表達(dá)。結(jié)果 91.7%（11/12）肝癌患者外周血樣本中檢測(cè)出CTCs，根據(jù)EMT標(biāo)志物，CTCs可被分為3個(gè)亞群，包括上皮型CTCs，上皮/間質(zhì)混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs。間質(zhì)型CTCs、NF-kB在肝癌外周血中表達(dá)率分別為66.7%（8/12）、83.3%（10/12）；NF-kB表達(dá)與CTCs檢出率、間質(zhì)型CTCs表達(dá)顯著相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論 NF-kB可能和肝癌的EMT發(fā)生有關(guān)，并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 肝癌；NF-kB；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；EMT

[中圖分類號(hào)] R735 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）06（b）-0019-03

[Abstract] Objective To study the expression of NF-kB in liver cancer and correlation with epithelial-mesenchymal transition. Methods Convenient selection The peripheral blood samples of 12 cases of liver cancer patients admitted and treated in our hospital from December 2014 to October 2015 were collected and the CTCs was isolated by the CanPatrol CTC second-generation enrichment technique， and the CTCs type was identified by the RNA-ISH and the expression of NF-kB was tested. Results The CTCs was tested in the peripheral blood samples of 91.7%（11/12） liver cancer patients， and CTCs could be divided into three subgroups according to the marker of EMT， including epitheliated type CTCs， epithelial / interstitial mixed type CTCs and interstitial type CTCs， and the expression rate of interstitial type CTCs and NF-kB in the peripheral blood of liver cancer was respectively 66.7%（8/12）and 83.3%（10/12）， and the expression of NF-kB was obviously correlated with the test rate of CTCs and expression of interstitial type CTCs（P<0.05）. Conclusion NF-kB may be related to the occurrence of EMT of liver cancer and promote the neoplasm metastasis.

[Key words] Liver cancer； NF-kB； Circulating tumor cell； EMT

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，CTCs的出現(xiàn)是發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提，是形成轉(zhuǎn)移灶的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腫瘤細(xì)胞在進(jìn)入外周血循環(huán)的過(guò)程中會(huì)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT），因此，根據(jù)EMT標(biāo)志物，CTCs可被分為：上皮型CTCs，上皮/間質(zhì)混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs，其中間質(zhì)型CTC具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛能。核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB可激活細(xì)胞因子或其受體基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)了非調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)而阻斷凋亡[1]。近來(lái)研究表明，NF-kB不僅可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，還與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系。該研究方便收集福建省龍巖市第二醫(yī)院2014年12月—2015年10月肝癌患者12例外周血樣本，旨在應(yīng)用CanPatrol CTC二代富集技術(shù)聯(lián)合RNA原位雜交技術(shù)分離和鑒定肝癌患者CTCs，并檢測(cè)NF-kB在肝癌中的表達(dá)，進(jìn)一步分析NF-kB與肝癌EMT的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究方便收集了福建省龍巖市第二醫(yī)院肝癌患者12例，男5例，女7例，年齡22～93歲，中位年齡58.5歲，全部病例經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為肝癌。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 分型雜交探針、NF-kB檢測(cè)探針由上海生工公司合成；154 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA、4%多聚甲醛溶液、PBS、DAPI、0.1×SSC、30%馬血清、1.5%SDS、3 mM Tris-HCl （pH=8.0）。

1.2.2 樣本采集 嚴(yán)格消毒后，應(yīng)用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管采集肘正中靜脈血5 mL靜脈血，采集后置于4℃保存并于4 h內(nèi)富集分離腫瘤細(xì)胞。

1.2.3 分離富集CTCs與檢測(cè) 將血液樣本從采血管轉(zhuǎn)移到樣本保存管中，室溫放置30 min后，離心去除上清，固定劑固定8 min，使用濾膜濾法富集得到CTCs。采用RNA-原位雜交法（RNA-ISH）檢測(cè)CTCs上皮標(biāo)志物、間質(zhì)標(biāo)志物和NF-kB mRNA。

1.2.4 CTCs的判定標(biāo)準(zhǔn) 及陽(yáng)性定義形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)胞呈圓形、橢圓形或長(zhǎng)形，直徑大于10 μm；②光鏡下可見(jiàn)完整細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核；③熒光下細(xì)胞形態(tài)及邊緣完整。RNA-ISH陽(yáng)性信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)果判定：由兩位經(jīng)培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)員在熒光顯微鏡下分別觀察細(xì)胞顯色情況，按照以上標(biāo)準(zhǔn)采集陽(yáng)性細(xì)胞圖像并計(jì)數(shù)。若存在分歧，則由第三人或更多協(xié)助下共同判定結(jié)果。陽(yáng)性界定值：目前尚無(wú)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化CTCs的陽(yáng)性界定標(biāo)準(zhǔn)，該研究以CTCs≥1判定為CTCs陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.5 CTCs分型標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)EMT標(biāo)志物，將CTCs分為：上皮型CTCs，上皮/間質(zhì)混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs。上皮型CTCs：上皮標(biāo)志物陽(yáng)性；上皮/間質(zhì)混合型CTCs：上皮標(biāo)志物和間質(zhì)型標(biāo)志物陽(yáng)性；間質(zhì)型CTCs：間質(zhì)型標(biāo)志物陽(yáng)性[2-3]。

1.2.6 NF-kB陽(yáng)性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn) NF-kB陽(yáng)性信號(hào)點(diǎn)呈紫色，位于細(xì)胞核內(nèi)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥1即為NF-kB陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，相關(guān)性評(píng)價(jià)采用Spearman雙變量相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC檢測(cè)結(jié)果

12例肝癌患者外周血樣本中，有11例檢出CTCs，陽(yáng)性率為91.7%（11/12），CTCs數(shù)量為1～26個(gè)，中位數(shù)6個(gè)。根據(jù)EMT標(biāo)志物，CTCs可被分為3個(gè)亞群，包括上皮型CTCs，上皮/間質(zhì)混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs。其中，8例肝癌患者外周血中檢出間質(zhì)型CTCs，表達(dá)率為66.7%（8/12）。

2.2 NF-kB表達(dá)

NF-kB mRNA主要定位于細(xì)胞核，呈紫色信號(hào)點(diǎn)。在12例肝癌患者外周血樣本中NF-kB陽(yáng)性表達(dá)10例，陽(yáng)性表達(dá)率為83.3%（10/12）。

2.3 NF-kB表達(dá)與肝癌患者CTCs、間質(zhì)型CTCs表達(dá)關(guān)系

對(duì)12例肝癌患者的NF-kB表達(dá)與CTCs、間質(zhì)型CTCs表達(dá)關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，NF-kB陽(yáng)性表達(dá)與CTCs檢出率、間質(zhì)型CTCs陽(yáng)性表達(dá)率均存在顯著正相關(guān)性（r=0.674，P<0.05；r=0.632，P<0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）被稱為腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的“種子”，與腫瘤患者病情惡化密切相關(guān)。雖然血液中檢測(cè)到CTCs并不代表著必定形成轉(zhuǎn)移灶，但CTCs的數(shù)量及生物學(xué)狀態(tài)可為臨床治療和用藥提供重要依據(jù)，有助于盡早發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)高危人群，加強(qiáng)這部分患者的隨訪并及時(shí)采取相應(yīng)的治療措施，對(duì)減少腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、提高患者生存率具有重要意義[2]。

CTC檢測(cè)一般包括兩個(gè)過(guò)程：分離和鑒定，目前CTCs檢測(cè)技術(shù)很多，其中又以依賴腫瘤細(xì)胞表面上皮特異性粘附分子（EpCAM）表達(dá)而富集和鑒定CTC的方法為常見(jiàn)，如美國(guó)食品藥監(jiān)局（FDA）審批通過(guò)的CellSeach系統(tǒng)。但是，CTCs發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及其異質(zhì)性使得傳統(tǒng)的依賴上皮特異性抗原表達(dá)來(lái)鑒定CTC的方法應(yīng)用受到限制，只能檢測(cè)到EpCAM陽(yáng)性的細(xì)胞，而無(wú)法檢測(cè)EpCAM陰性的細(xì)胞[3-6]。

與基于表皮標(biāo)志物的CTC檢測(cè)技術(shù)相比，CanPatrol CTC二代富集技術(shù)具有更高的靈敏度，在5 mL血液樣本中可檢測(cè)到更多的CTCs，不僅可以檢測(cè)到上皮型CTCs，還可以檢測(cè)到間質(zhì)型及上皮/間質(zhì)混合型CTCs[7-8]。Zhao[8]應(yīng)用CanPatrol CTC二代富集技術(shù)對(duì)1 203例結(jié)直腸癌患者的CTCs進(jìn)行計(jì)數(shù)與分型，在1 046例患者中檢出CTCs，檢出率為86.9%，而CellSeach系統(tǒng)檢出率約為5%左右。該研究采用CanPatrol CTC二代富集技術(shù)，先使用過(guò)濾的方法分離CTCs，然后基于分支DNA信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行RNA原位雜交（RNA-ISH），通過(guò)EMT標(biāo)志物對(duì)不同癌種中的CTCs進(jìn)行了EMT分型，12例肝癌患者外周血樣本中，有11例檢出CTCs，檢出率為91.7%（11/12）。其中，8例肝癌患者外周血中檢出間質(zhì)型CTCs，表達(dá)率為66.7%（8/12）。該結(jié)果證實(shí)了CanPatrol CTC二代富集技術(shù)具有高檢出率及可更全面檢測(cè)所有類型CTCs的特點(diǎn)。

NF-kB是由RelA（P65）、RelB、C-Rel、NF-kB1（P50）、NF-kB2（P52）組成，其編碼的產(chǎn)物由同源和各種異源的NF-kB/Rel蛋白二聚體構(gòu)成，多為P50和P65，通過(guò)與其抑制蛋白IkB結(jié)合，參與下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活一系列激酶，從而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)[1]。

NF-kB不僅參與了腫瘤的發(fā)生，而且與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。徐沙沙等[9-10]報(bào)道了非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中NF-kB的表達(dá)與EMT密切相關(guān)，NF-kB可能協(xié)同Slug抑制E-cadherin表達(dá)，促進(jìn)Vimentin表達(dá)，誘使NSCLC的EMT發(fā)生；此外，NF-kB還與分化程度（χ2=5.024，P<0.05）、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=6.174，P<0.05）及腫瘤的分期（χ2=7.317，P<0.01）有關(guān)。

該研究觀察了NF-kB與CTCs的關(guān)系，初步研究表明肝癌外周血中NF-kB陽(yáng)性表達(dá)與CTCs檢出率、間質(zhì)型CTCs陽(yáng)性表達(dá)率具有一定相關(guān)性，未來(lái)的研究應(yīng)擴(kuò)大樣本量并對(duì)患者進(jìn)行隨訪觀察，進(jìn)一步探討NF-kB、CTCs與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系，以期研究NF-kB、CTCs在肝癌診斷、治療及預(yù)后的臨床價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Panday A.Transcription Factor NF-kappaB： An Update On Intervention Strategies[J].Arch Immunol Ther Exp （Warsz）， 2016， 64（6）：463-483.

[2] Gallerani GP. Fici F.Fabbri、Circulating Tumor Cells：Back to the Future[J].Front Oncol， 2016（6）：275.

[3] Liu H，Zhang X，Li J，et al.The Biological And Clinical Importance Of Epithelial-Mesenchymal Transition In Circulating Tumor Cells[J].J Cancer Res Clin Oncol，2015（141）：189-201.

[4] Jolly MK， Boareto M， Huang B，et al.Implications Of The Hybrid Epithelial/Mesenchymal Phenotype In Metastasis[J].Front Oncol， 2015（5）：155.

[5] Satelli A， Mitra A， Brownlee Z，et al.Epithelial-Mesenchymal Transitioned Circulating Tumor Cells Capture For Detecting Tumor Progression[J].Clin Cancer Res， 2015（21）：899-906.

[6] Jolly MK， Tripathi SC， Jia D，et al. Stability Of The Hybrid Epithelial/Mesenchymal Phenotype[J].Oncotarget，2016（7）：27067-27084.

[7] Wu S.Classification Of Circulating Tumor Cells By Epithe lial-Mesenchymal Transition Markers[J]. Plos One， 2015，10（4）：e0123976.

[8] Zhao R. Expression And Clinical Relevance Of Epithelial And Mesenchymal Markers In Circulating Tumor Cells From Colorectal Cancer[J]. Oncotarget， 2017，8（6）：9293-9302.

[9] 徐沙沙，項(xiàng)鋒鋼，黨受琴，等. NF-kB與Slug在非小細(xì)胞肺癌及其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012， 12（17）：3232-3238.

[10] 石磊，王世明，賀杰峰.核轉(zhuǎn)錄因子-κB在胰腺癌中的表達(dá)及其與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系[J].腫瘤研究與臨床，2011，23（3）：191-193.

（收稿日期：2017-03-16）