吳平平

【摘要】 目的 探討納米囊制劑對白血病多藥耐藥細胞的影響。方法 采用溶劑揮發(fā)法制備共載中藥甘草酸（GA）及化療藥物柔紅霉素（DNR）的納米囊， 將其分為P-gp Ab修飾共載中藥GA及化療藥物DNR組（A組）；P-gp Ab修飾裝載DNR化療藥物組（B組）；DNR化療藥物組（C組）；DNR+GA組（D組）；P-gp Ab修飾納米囊空載組（E組）；GA組（F組）；生理鹽水對照組（G組）。采用體外四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法評價細胞毒作用（白血病多藥耐藥細胞K562/A02）， 采用流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況， 采用化學發(fā)光自顯影免疫印跡法（Western Blot）檢測蛋白B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白（Bax）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）的表達。結果 A組的K562/A02的半抑制濃度指數（IC50）為（3.65±1.06）， 其降低效果優(yōu)于其他組（P<0.05）。B組IC50為（3.12±0.96）， 低于C、D、F組的（0.95±0.04）、（0.96±0.03）、（0.94±0.05）（P<0.05）。C、D、F組的耐藥指數（RE）均接近1， 故認為對K562/A02的細胞無增強耐藥作用， 也無毒性作用。E組和G組為對照組， 檢測到的細胞掉凋亡率較小， 不計入比較。A組的細胞總凋亡率高于其他各組（P<0.05）。B組的細胞凋亡率高于C、D、F組（P<0.05）。A組的Bcl-2的表達低于其他各組， Bax的表達高于其他各組（P<0.05）。E組和G組的Bcl-2表達均高于其他各組， Bax的表達均低于其他各組， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 納米囊制劑對白血病多藥耐藥細胞具有細胞毒性， 中藥GA+化療藥物DNR具有明顯的協(xié)同效果， 其作用機制可能與上調Bax表達與下調Bcl-2有關。

【關鍵詞】 納米囊制劑；白細胞；多藥耐藥；K562/A02；體外實驗

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.23.002

In vitro experimental study of effects of nanocapsules on multidrug resistance of leukemia cells WU Ping-ping. Department of Internal Medicine-Oncology， Jiangsu Province Tumor Hospital， Nanjing 210009， China

【Abstract】 Objective To investigate the effect of nanocapsules on multidrug resistance of leukemia cells. Methods Nanocapsules containing Chinese medicine glycyrrhizin （GA） and chemotherapy drug daunorubicin （DNR） were prepared by solvent evaporation method. They were divided into P-gp Ab modified loading traditional Chinese medicine GA and chemotherapy drug DNR group （group A） and P-gp Ab modified loading DNR chemotherapy group （group B）， DNR chemotherapy drug group （group C）， DNR+GA group （group D），

P-gp Ab modified nanocapsules empty group （group E）， GA group （group F） and saline control group（group G）. The cytotoxicity （leukemia multidrug resistance cell K562 / A02） was evaluated by methylthio tetrazole （MTT） colorimetric assay， apoptosis was detected by flow cytometry， and the expression of B-cellymphoma-2 associated X protein （Bax） and B-cellymphoma-2 （Bcl-2） were detected by chemiluminescence autoradiography （Western Blot）. Results Group A had semi inhibitory concentration index （IC50） of K562/A02 as （3.65±1.06）， and its reduction effect was better than the other groups （P<0.05）. Group B had IC50 as （3.12±0.96）， which were lower than （0.95±0.04）， （0.96±0.03） and （0.94±0.05） in group C， group D and group F （P<0.05）. The resistance factor （RI） of group C， D and F was close to 1， so it was considered that the K562/A02 cells had no enhanced drug resistance and non-toxic effect. Group E and group G as the control group， their detected cell outage rate was small， so they were not included in the comparison. Group A had higher total cell apoptosis rate than the other groups （P<0.05）. Group B had higher cell apoptosis rate than group C， group D and group F （P<0.05）. Group A had lower expression of Bcl-2 than the other groups， and higher expression of Bax than the other groups （P<0.05）. Group E and group G had higher expression of Bcl-2 than the other groups， and lower expression of Bax than the other groups. Their difference was statistical significant （P<0.05）. Conclusion Nanocapsules can be cytotoxic to leukemia multidrug resistance cells， and the Chinese medicine GA+ chemotherapy drug DNR has obvious synergistic effect， and its mechanism may be related to up-regulation of Bax expression and down-regulation of Bcl-2 expression.

【Key words】 Nanocapsules； White blood cell； Multidrug resistance； K562/A02； In vitro experiment

白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病， 其原因不明， 發(fā)病率居惡性腫瘤的第六位?；熓侵委煱籽〉氖走x治療方法， 但由于腫瘤多藥耐藥性現象的出現， 化療失敗以及難治性白血病時有發(fā)生。尋找低毒高效的白血病多藥耐藥逆轉劑已經成為當前研究的熱點。納米粒是一種新型的藥物載體系統(tǒng)， 其能改變藥物在人體內的分布， 可延長藥物的作用時間 [1]。本研究旨在納米囊制劑對白血病多藥耐藥細胞的影響， 以期為白血病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1. 1 細胞株 白血病多藥耐藥細胞K562/A02（中國醫(yī)學科學院血液學研究所提供）。

1. 2 試劑與儀器

1. 2. 1 主要試劑 IMDM培養(yǎng)基， 胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）， 實時熒光定量檢測試劑盒（武漢博士的生物制藥有限公司）， 兔抗人P-gp抗體（Abcam， 美國）， B淋巴細胞瘤-2基因、B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白上下引物（上海英維捷基有限公司）， 二甲基亞砜（DMSO， Sigma， 純度>99%， 美國）， MTT（AMRESCO， 美國）， 細胞計數試劑盒（日本同仁公司）等。

1. 2. 2 主要儀器 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）， 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）， 熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad 公司， CFX96型）， 倒置生物顯微鏡（日本尼康 TS100-F）， 冷凍離心機（美國Eppendorf 公司）， SDS 凝膠電泳槽（大連競邁生物）等。

1. 3 方法

1. 3. 1 納米囊制劑的制備 采用溶劑揮發(fā)法制備共載中藥GA及化療藥物DNR的納米囊， 采用差速離心分離法可對納米囊進行不同粒徑的分離和篩選， 根據實驗需要收集直徑<1000 nm的納米囊溶液樣品， 進行后面的實驗分析和研究。戊二醛交聯法構建P-gp Ab偶聯納米囊。將其分為P-gp Ab修飾共載中藥GA及化療藥物DNR組（A組）；P-gp Ab修飾裝載DNR化療藥物組（B組）；DNR化療藥物組（C組）；DNR+GA組（D組）；P-gp Ab修飾納米囊空載組（E組）；GA組（F組）；生理鹽水對照組（G組）。

1. 3. 2 細胞株及細胞培養(yǎng) 白血病多藥耐藥細胞K562/A02， 置于含有10% 新生牛血清的RPMI 1640（鏈霉素100 μg/ml、青霉素100 IU/ml）培養(yǎng)基中， 于含有5%二氧化碳、95%濕度的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1. 3. 3 細胞毒性測定 采用MTT法[2]測定波長為540 nm， 繪制生長曲線， 計算IC50及RF。

1. 3. 4 細胞凋亡 采用流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況， 取對數生長期的K562/A02細胞， 加入6孔板內， 根據分組的情況加入不同藥物。培養(yǎng)24 h。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次， 加入相關藥物混勻后， 4℃避光保存。

1. 3. 5 Bax、Bcl-2蛋白的表達 采用Western Blot檢測， 取對數生長期的K562/A02細胞， 調整細胞濃度， 收集細胞。按照常規(guī)方法裂解細胞提取總蛋白， 二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度， 將聚偏氟乙烯（PVDF）膜置于其中封閉2 h。一抗4℃過夜， 加入二抗后室溫孵育 2 h， 將PVDF膜從一抗中取出TBS-T中漂洗3次， 以凝膠成像儀對條帶進行成像， 用Image圖像分析軟件計算的灰度值。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計學軟件對數據進行處理。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 納米囊制劑的細胞毒性作用 A組的K562/A02的IC50為（3.65±1.06）， 其降低效果優(yōu)于其他組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。B組IC50為（3.12±0.96）， 低于C、D、F組的（0.95±0.04）、（0.96±0.03）、（0.94±0.05）， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。C、D、F組的RF均接近1， 故認為對K562/A02的細胞無增強耐藥作用， 也無毒性作用。

2. 2 納米囊制劑對耐藥細胞K562/A02凋亡率的影響 E組和G組為對照組， 檢測到的細胞掉凋亡率較小， 不計入比較。A組的細胞總凋亡率高于其他各組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。B組的細胞凋亡率高于C、D、F組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 3 納米囊制劑對耐藥細胞K562/A02細胞Bax、Bcl-2的表達的影響 A組的Bcl-2的表達低于其他各組， Bax的表達高于其他各組， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。E組和G組的Bcl-2表達均高于其他各組， Bax的表達均低于其他各組， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

多藥耐藥可導致機體對化療藥物的敏感性較低， 是白血病化療失敗和復發(fā)的重要原因， 已經成為臨床上亟待解決的問題。多藥耐藥的作用與酶轉移系統(tǒng)、膜轉運蛋白， 抗凋亡通路激活和抗凋亡基因表達有關。細胞凋亡受到細胞內凋亡調節(jié)蛋白的調控， 該類蛋白分為兩種， 促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。當兩種蛋白比例失衡時容易引發(fā)細胞凋亡[3， 4]。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白， 通過其編碼的Bcl-2蛋白而發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用。Bax是一種抗凋亡蛋白， 其表達水平增高時責促進細胞凋亡。細胞內Bax/Bcl-2決定細胞是生存還是凋亡。通過藥物干預凋亡相關基因的表達， 調控細胞內信號傳導途徑， 以減少細胞凋亡， 可能會成為克服多藥耐藥醫(yī)學難題的重要突破點。

本研究采用納米囊制劑對白血病多藥耐藥細胞進行干預結果發(fā)現， P-gp Ab修飾共載中藥GA及化療藥物DNR對耐藥菌株K562/A02細胞毒性較強， 能夠顯著促進細胞凋亡， 效果均好于化療DNR+中藥組、單純中藥組、單純化療DNR組以及P-gp Ab修飾裝載DNR化療藥物組， 差異均有統(tǒng)計學意義。納米粒子是指粒度在1～100 nm之間的粒子， 粒徑小且分布窄， 容易穿過生理屏障， 達到藥物本身無法到達的地方， 并具有緩、控釋作用， 不僅藥物作用時間長， 而且可主動達到鞭向部位[5， 6]。納米載體治療已經成為抗腫瘤藥物的新興熱點， 其無論單方藥還是復方藥均可包載。中藥逆轉白血病多藥耐藥的作用已經陸續(xù)被報道， 其可增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性， 抑制外排泵ABC轉運蛋白表達逆轉腫瘤多藥耐藥性[7， 8]。本研究采用P-gp Ab修飾共載中藥GA及化療藥物DNR對白血病耐藥菌株K562/A02的逆轉效果好。

綜上所述， 納米囊制劑對白血病多藥耐藥細胞具有細胞毒性， 中藥GA+化療藥物DNR具有明顯的協(xié)同效果， 其作用機制可能與上調Bax表達與下調Bcl-2有關。

參考文獻

[1] 劉苒. 轉鐵蛋白修飾的新型多聚物載藥納米粒的研制及靶向逆轉白血病多藥耐藥的體外研究. 東南大學， 2015.

[2] 李秀軍， 姚宇紅， 嚴魯萍. 干擾素對白血病多藥耐藥細胞HL60/VCR的影響. 廣東醫(yī)學， 2014（12）：1836-1837.

[3] 李秀軍， 姚宇紅， 嚴魯萍. 干擾素對白血病多藥耐藥細胞HL60/VCR的影響// 中西醫(yī)結合血液高峰論壇， 2014：1836-1837.

[4] 林婷， 廖斌， 徐成波， 等. 中藥復方君子湯聯合阿霉素逆轉白血病K562/VCR細胞多藥耐藥及誘導凋亡的機制研究. 廣州中醫(yī)藥大學學報， 2017， 34（1）：95-100.

[5] 廖斌， 葛仁英， 徐成波， 等. 中藥復方君子湯對白血病細胞株K562/VCR耐藥性的逆轉作用. 康復學報， 2011， 21（4）：9-12.

[6] 何玉芳. 川芎嗪主動靶向納米粒逆轉腫瘤細胞多藥耐藥作用研究. 大連醫(yī)科大學， 2013.

[7] 劉向陽. 多肽殼聚糖川芎嗪納米粒逆轉腫瘤細胞耐藥作用研究. 大連醫(yī)科大學， 2016.

[8] 吳玉強， 薛文翰. 中藥逆轉白血病細胞多藥耐藥的研究進展. 甘肅醫(yī)藥， 2016， 35（4）：267-269.

[收稿日期：2017-05-19]