劉軍，黃文秀，劉汝萃，牛祥臣，李成輝，王吉龍

（山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東禹城251200）

不同水解度下的大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)表征

劉軍，黃文秀，劉汝萃，牛祥臣，李成輝，王吉龍

（山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東禹城251200）

利用中性蛋白酶水解大豆分離蛋白（SPI），并通過(guò)熒光探針?lè)?、SGS-PAGE凝膠電泳及掃描電鏡技術(shù)對(duì)不同水解度（DH）下的SPI的疏水性進(jìn)行分析，且對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行表征。結(jié)果表明：隨著水解度的增加，SPI的表面疏水性呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。通過(guò)不同DH下制備的SPI的電泳分析，隨著DH的增大，SPI被逐漸水解形成更多的低分子量多肽，且不同DH下的SPI的多肽與亞基分布相似，隨著DH的增大，SPI的低分子量多肽含量先增大后降低，新增的聚集肽含量增多。不同DH下的SPI，皆呈單個(gè)球狀蛋白分布，分布較為松散，每個(gè)球狀蛋白上皆有亞基分布，大部分球蛋白球體表面呈塌陷狀態(tài)，隨SPI的DH增大，SPI的球蛋白表面塌陷越明顯，且亞基未被解離。

大豆分離蛋白；水解度；表面疏水性；結(jié)構(gòu)表征

蛋白可分為植物蛋白和動(dòng)物蛋白，其中大豆蛋白是含量最為豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)之一[1-2]，具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：1）大豆蛋白含有人體所需的8種必需氨基酸，且比例合理，皆符合WHO的標(biāo)準(zhǔn)；2）我國(guó)生產(chǎn)大豆，因此大豆蛋白來(lái)源廣泛，價(jià)格相對(duì)低廉；3）大豆蛋白為天然植物蛋白，不含膽固醇，并且符合人體健康的需求；4）大豆蛋白具有優(yōu)良的乳化性、發(fā)泡性和凝膠性，是食品工業(yè)應(yīng)用的重要蛋白質(zhì)。但大豆蛋白由于其分子量大、溶解度低、含有抗?fàn)I養(yǎng)因子以及具有抗原性等因素而大大限制了大豆蛋白產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域[3]。目前針對(duì)大豆蛋白的改性研究則比較集中于化學(xué)方法和酶改性方法。但在化學(xué)方法改性的過(guò)程中會(huì)添加一些化學(xué)試劑，因此不能直接用于食品中；蛋白質(zhì)酶促水解是在水溶液中通過(guò)酶的催化作用，使蛋白質(zhì)中的肽鍵斷裂，生成胨、肽等低分子量產(chǎn)物的生化反應(yīng)過(guò)程。蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解有助于改善其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能性質(zhì)，從而拓寬其應(yīng)用范圍。大豆蛋白水解能改善溶解度、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)以及降低過(guò)敏性，產(chǎn)品能應(yīng)用于乳制品、肉類、飲料以及嬰兒食品中，在食品蛋白質(zhì)配料加工方面有著特殊意義[4-7]。

本研究采用中性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行酶解，測(cè)定其水解度與蛋白表面疏水性關(guān)聯(lián)曲線，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳與掃描電鏡對(duì)酶解后的大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，旨在更好了解中性蛋白酶水解大豆分離蛋白的機(jī)理，并為開(kāi)發(fā)大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白：山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；中性蛋白酶：（100 000 U/g，杰能科生物工程有限公司，中國(guó)）被保存于-4℃。其它試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F-4500熒光分光光度計(jì)、SN-3400掃描電鏡：日本日立公司；DYY-8C電泳儀、DYY-8C電泳槽：北京市六一廠；Gel k8160凝膠成像分析系統(tǒng)：北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限公司；DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；868型pH計(jì)：上海熱電儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活測(cè)定

利用GB/T23527-2009《蛋白酶制劑》中蛋白酶活力的測(cè)定方法，采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活力，酶活力單位為U/mL。

1.3.2 中性蛋白酶水解大豆分離蛋白

經(jīng)李和平[8]等的方法稍作修改后，利用中性蛋白酶對(duì)SPI進(jìn)行水解。稱取20 g SPI溶于蒸餾水中，使其底物濃度為5%，于90℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，用1 mol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0，溶液冷卻至45℃，加入0.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）中性蛋白酶，于45℃水浴鍋中恒定pH值7.0緩慢攪拌一定時(shí)間。將水解后溶液置于90℃水浴中滅酶20 min，冷卻至室溫后，加蒸餾水稀釋剪切后進(jìn)行噴霧干燥，得到酶解大豆分離蛋白。

1.3.3 水解度測(cè)定

將SPI經(jīng)水解后得到的溶液采用Alder-Nissen方法進(jìn)行水解度測(cè)定[9]。水解度被定義為被破壞的肽鍵數(shù)（h）占單位重量總肽鍵數(shù)（htot）的百分比，通過(guò)加入的NaOH維持pH值恒定的量計(jì)算水解度，計(jì)算公式如下式（1）所示：

式中：B為維持水解時(shí)的pH值恒定的NaOH體積數(shù)，mL；Nb為常量；Mρ：蛋白質(zhì)質(zhì)量（g，%N×6.25）；1/α為pH-stat方法的校準(zhǔn)因子；htot：肽鍵含量。

1.3.4 表面疏水性測(cè)定

經(jīng)Seronei方法稍作修改[10]后，對(duì)SPI樣品進(jìn)行表面疏水性測(cè)定。用1-苯胺-8奈（ANS）作為熒光探測(cè)劑。用磷酸緩沖液稀釋（0.01 mol/L，pH7.0）稀釋酶解后的SPI樣品為不同濃度（0.005%、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%），用0.01 mol/L pH值為7.0的磷酸緩沖溶液配制成8.0 mmol/L的ANS，并將20 μL ANS與酶解后的SPI樣品溶液混合，于激發(fā)波長(zhǎng)390 nm和發(fā)射波長(zhǎng)470 nm測(cè)定熒光強(qiáng)度（FI）。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度作圖，回歸曲線的初始斜率為表面疏水性。

1.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳分析

將不同水解度下的SPI樣品與Tris緩沖溶液（0.06 mol/L，pH 6.8）混合，其中含β-巰基乙醇（體積分?jǐn)?shù) 5%）、甘油（25 g/100 mL）、SDS（2 g/100 mL）、溴甲酚藍(lán)（0.1 g/100 mL），于沸水浴中加熱5 min后用于SDSPAGE凝膠電泳分析。

該SDS-PAGE凝膠電泳采用3層不連續(xù)膠的混合使用，即分離膠＋夾層膠＋濃縮膠結(jié)構(gòu)，此3層膠皆由不同比例組成的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液聚合形成。凝膠的配制方法如表1所示。

表1 分離膠、夾層膠和濃縮膠的組成Table 1 Composition of separating gel，laminated gel and concentrate gel

分離膠、夾層膠和濃縮膠的膠體積比為4∶1.5∶1（體積比）。電泳時(shí)，先將電壓調(diào)至80 V，待指示前沿到達(dá)分離膠時(shí)，把電壓調(diào)至120 V，直至電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后，將膠片染色12 h（考馬斯亮藍(lán)R-250染色液：42%的95%乙醇和10%冰乙酸，0.1 g）。染色結(jié)束后用脫色液（包含7%甲醇，30%冰乙酸）洗脫膠片，直至蛋白質(zhì)條帶變?yōu)榍逦鸀橹?。并采用凝膠成像系統(tǒng)軟件Labwork 4.5軟件進(jìn)行處理并分析[11]。

1.3.6 掃描電鏡分析

取適量不同水解度的SPI樣品均勻粘在掃描電鏡觀察臺(tái)上，用離子濺射鍍膜儀在蛋白表面噴金，約10 nm厚。處理好的樣品置于樣品盒中，加速電壓為20 kV，用掃描電子顯微鏡放大500倍下觀察SPI的微觀結(jié)構(gòu)[12]。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

除非另有說(shuō)明，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并且結(jié)果表示為重復(fù)分析的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用SPSS系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA）分析和最小顯著差異（LSD）實(shí)驗(yàn)。顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI的水解曲線

對(duì)比水解SPI不同時(shí)間對(duì)其水解度的影響。選擇1 h～7 h進(jìn)行水解，每隔1 h對(duì)水解度進(jìn)行測(cè)定，SPI被中性蛋白酶水解曲線如圖1所示。

圖1 SPI水解不同時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.1 Influence in hydrolysis degree over time of SPI

由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度程增長(zhǎng)趨勢(shì)。在SPI水解初期，水解度明顯增長(zhǎng)，之后其增長(zhǎng)速度逐漸趨于緩慢。水解時(shí)間從1 h至7 h過(guò)程中，水解度顯著增加（P＜0.05）。其中當(dāng)水解 5 h～7 h時(shí)，水解度增加不顯著（P＜0.05）。由水解曲線表明，水解前4小時(shí)，SPI的水解速度較快。在前4小時(shí)內(nèi)，每隔1 h，測(cè)定得到的水解度均出現(xiàn)顯著增長(zhǎng)的變化。在水解5 h～7 h過(guò)程中，水解的增長(zhǎng)速度趨于平緩，此時(shí)的酶促反應(yīng)趨于平穩(wěn)階段，水解度無(wú)明顯增加。水解度隨SPI水解時(shí)間的變化趨勢(shì)與Chen等利用胰蛋白酶對(duì)蛋清蛋白酶解的研究結(jié)果相似[13]，結(jié)果表明：水解1 h時(shí)，其水解的增長(zhǎng)速度較快，之后呈降低趨勢(shì)，直到5 h后水解度無(wú)明顯增加。

2.2 SPI的表面疏水性分析

蛋白質(zhì)的疏水作用對(duì)其構(gòu)象、穩(wěn)定性和功能性具有重要意義。且蛋白質(zhì)的表面疏水性對(duì)其分子間的相互作用也有較大影響，因此，表面疏水性是蛋白質(zhì)的一個(gè)重要性質(zhì)。本穩(wěn)對(duì)研究了不同水解度下的SPI與表面疏水性的關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。

SPI的DH與表面疏水性的關(guān)系如圖2所示，隨著水解度的增長(zhǎng)，SPI的表面疏水性呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。當(dāng)DH在6.5至18.5之間時(shí)，SPI的表面疏水性明顯增加（P＜0.05）。當(dāng)SPI的DH為6.5%時(shí)，其表面疏水性為

圖2 SPI的水解度與表面疏水性的關(guān)系Fig.2 Relationship between hydrolysis degree and surface hydrophobicity

2.3 SPI的SDS-PAGE凝膠電泳分析

對(duì)不同水解度下的SPI進(jìn)行SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳分析，以分子量13 kDa～210 kDa的標(biāo)準(zhǔn)蛋白做對(duì)照，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同水解度下的SPI的凝膠電泳圖Fig.3 Electrophoretic pattern of different SPI in degree of hydrolysis

圖3為不同水解度下制備得到的SPI電泳圖，圖中顯示了蛋白質(zhì)的分子量分布。正如圖3所示：SPI經(jīng)中性蛋白酶酶解后形成的SP分子量分布情況來(lái)看，少部分多肽或亞基的分子量大于210 kDa，而大部分多肽或亞基集中分布在 210kDa～20kDa（圖 3，泳道 1～6）。

如圖3所示，隨著水解度的增大，SPI被逐漸水解形成更多的低分子量多肽，且不同水解度下的SPI的多肽與亞基分布相似（圖3，泳道1～6）。通過(guò)不同水解度下制備的SPI電泳圖對(duì)比，發(fā)現(xiàn)水解度為13.7的SPI中分子量小于20 kDa的小肽（圖3，泳道3中的條帶e）和水解度為18.5的SPI中分子量小于20 kDa的小肽（圖3，泳道4中的條帶e）含量在其他不同水解度下制備的SPI的電泳圖中減小，且水解度分別為6.5、7.7、20.1、21.4的SPI的條帶在17.5 kDa以下無(wú)分布（圖 3-2，泳道 1、2、5、6，e條帶所示）。同時(shí)，在不同水解度下制備得到的SPI的電泳圖中，我們發(fā)現(xiàn)隨著水解度的增大，SPI的電泳圖中部分條帶顏色先變淺后加深（圖 3，泳道 1～6 的條帶 a，b，c，d，泳道 6，條帶 b所示）。根據(jù)其他研究者報(bào)道[19-20]，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，新條帶的形成或條帶的加深表明有新的聚集肽生成，這些聚集肽可能是由許多低分子量的肽聚集產(chǎn)生。因此隨著水解度的繼續(xù)增加，疏水集團(tuán)暴露增加，亞基與亞基之間通過(guò)疏水相互作用形成聚集體，二者結(jié)合越多，所以在水解度為20.1和21.4環(huán)境下制備的SPI的該區(qū)域的條帶顏色加深，聚集肽含量增加。

2.4 SPI的掃描電鏡分析

為了觀察不同水解度下的SPI的微觀結(jié)構(gòu)變化，因此，分別對(duì)其進(jìn)行掃描電鏡測(cè)定，如圖4所示。

圖4 不同水解度下的SPI的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.4 SEM images of different SPI in degree of hydrolysis

圖 4 中（a）、（b）、（c）、（d）各圖分別為不同水解度下的SPI的掃描電鏡圖片，其觀察倍數(shù)為500倍。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，不同水解度下的SPI微觀結(jié)構(gòu)分布，皆呈單個(gè)球狀蛋白分布，且分布較為松散，同時(shí)每個(gè)球狀蛋白上皆有亞基分布，大部分球蛋白球體表面呈塌陷狀態(tài)（圖4）。由圖4可知，經(jīng)酶解后的SPI球蛋白表面呈塌陷狀，且通過(guò)不同水解度下的SPI的掃描電鏡圖對(duì)比可知：隨SPI的水解度增大，大豆分離蛋白的球蛋白表面塌陷越明顯，且亞基未被解離。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)水解SPI不同時(shí)間的水解度測(cè)定，同時(shí)采用熒光探針?lè)▽?duì)不同水解度下制備的SPI的表面疏水性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度程增長(zhǎng)趨勢(shì)。在SPI水解初期，水解度明顯增長(zhǎng)，之后其增長(zhǎng)速度逐漸趨于緩慢；隨著水解度的增長(zhǎng)，SPI的表面疏水性呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。通過(guò)不同水解度下制備的SPI的電泳分析，隨著水解度的增大，SPI被逐漸水解形成更多的低分子量多肽，且不同水解度下的SPI的多肽與亞基分布相似，隨著水解度的增大，SPI的低分子量多肽含量先增大后降低，且新增的聚集肽的含量增多。SPI微觀結(jié)構(gòu)分布，皆呈單個(gè)球狀蛋白分布，且分布較為松散，同時(shí)每個(gè)球狀蛋白上皆有亞基分布，大部分球蛋白球體表面呈塌陷狀態(tài)隨SPI的水解度增大，SPI的球蛋白表面塌陷越明顯，且亞基未被解離。

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Structural Characterization of Soybean Protein Isolation at Different Hydrolysis Degree

HUANG Wen-xiu，LI Cheng-hui，WANG Ji-long，TANG Ming-li，ZHAO Fei，CHEN Peng
（Shandong Yuwang Ecogical Food Industry Co.，Ltd.，Yucheng 251200，Shandong，China）

The hydrolysis of soybean protein isolated（SPI）at neutral protease，for forming soybean protein isolation at different hydrolysis degree（DH）.The surface hydrophobicity，secondary structure and microstructure of SPI have been investigated by using a combination of determination of fluorescence probe，SGS-PAGE and transmission electron microscopy（TEM）methods.The result showed that：with the increase of DH，The surfacehydrophobicity was on the rise.SPI was hydrolyzed to form gradually more low molecular weight peptides，the peptides and base were similar.With the increase of DH，the content of low molecular weight peptides was first increased and then decreased，and the content of the new accumulation peptide was increased.Distribution of SPI at different DH was single globular protein，and relatively loose，the base was distributed on each of the globular protein，sphere surface of most of the globular protein was on subsidence.With the increase of DH，the subsidence of sphere surface of globular protein was obvious，and the base was not dissociation.

soybean protein isolated；hydrolysis degree；surface hydrophobicity；structure characterization

2016-11-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.006

黃文秀（1989—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品科學(xué)。