張倩，劉睿，3，程建明，3，王欣之，3，杜俊潮，張文英，吳皓，3，*

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京210023；2.江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室，江蘇南京210023；3.江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇南京210023）

四角蛤蜊核苷類成分純化工藝研究

張倩1，2，劉睿1，2，3，程建明1，2，3，王欣之1，2，3，杜俊潮1，2，張文英1，2，吳皓1，2，3，*

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京210023；2.江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室，江蘇南京210023；3.江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇南京210023）

采用大孔吸附樹脂與陽離子交換樹脂串聯(lián)純化四角蛤蜊醇沉上清液中核苷類成分，以核苷的純度和回收率為指標，考察樹脂的型號、上樣濃度、水洗體積、洗脫劑濃度及流速對純化效果的影響，以期得到最佳的純化工藝。確定大孔吸附樹脂的型號及最佳工藝為：SP207型，質量濃度250 mg/mL，pH值為5.0，水洗除雜體積是3 BV，洗脫液為體積分數5%乙醇。進一步通過離子交換樹脂純化，確定樹脂型號及最佳純化工藝為：001*7陽離子交換樹脂，質量濃度6.3 mg/mL，氨水∶乙醇（體積比3∶30）溶液洗脫，洗脫流速是3 BV/h。經兩種樹脂串聯(lián)純化后，四角蛤蜊醇沉上清液中核苷類成分的質量分數由1.80%提高至50.60%，總回收率為70.32%。工藝驗證結果表明SP207大孔吸附樹脂與001*7陽離子交換樹脂串聯(lián)純化核苷類成分的方法穩(wěn)定可行，能夠用于四角蛤蜊核苷類成分的分離純化。

四角蛤蜊；核苷；大孔吸附樹脂；陽離子交換樹脂；純化

四角蛤蜊（Mactra veneriformis）生長于灘涂潮間帶，為江蘇沿海重要經濟貝類之一[1]。四角蛤蜊屬軟體動物門（Mollusca），瓣鰓綱（Lamellibranchia），真瓣鰓目（Eulamellibranchia），蛤蜊科（Mactridae），始載于《本草經集注》，味甘、咸，性寒，具有滋陰利水，化痰軟堅等功效。前期研究將四角蛤蜊軟體經水提醇沉，得到上清液和沉淀兩部分，其中沉淀部位主要含有粗多糖，具有較好的免疫調節(jié)及輔助降血糖的功效[2]，已開發(fā)相關功能食品；上清液部位含有氨基酸、寡肽、核苷等成分，具有保肝與抗氧化功能[3-4]。前期研究表明四角蛤蜊中富含次黃嘌呤、黃嘌呤、肌苷等多種核苷類成分[5]，現(xiàn)代研究表明核苷具有抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節(jié)、基因治療[6-7]等多種生物活性?；谘睾５椭地愵惾祷C合利用的思路，提升低值貝類的附加值，本試驗對四角蛤蜊上清液中的核苷類物質進行富集與純化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四角蛤蜊：江蘇省海洋水產研究所，批號為20150714，經江蘇省海洋水產研究所萬夕和研究員鑒定為蛤蜊科動物四角蛤蜊Mactra veneriformisReeve。

次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、2-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、2-脫氧肌苷、2-脫氧鳥苷（純度均大于99%）：美國 Sigma公司，；SK1B、PK228、JK008、D113、D001、001×16、001×7 型陽離子樹脂：河北滄州寶恩樹脂有限公司；SP207、AB-8、HPD100、HPD250、HPD400、HPD500大孔吸附樹脂：北京綠百草科技發(fā)展有限公司；甲醇（色譜純）：德國默克公司；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2489 UV檢測器：美國Waters公司；3-16pk高速離心機：美國sig ma公司；R-210旋轉蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；UNIQUE-s15超純水機：美國Millipore公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；BT-125D型電子分析天平：德國Satrourius公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 四角蛤蜊醇沉上清液的制備

取四角蛤蜊吐沙，去殼，得新鮮軟體，稱重，加入3倍量水煎煮，每次45 min，煎煮2次，將濾液濃縮至原軟體質量的1/3，10 000 r/min離心10 min，去沉淀，得上清液，加乙醇調節(jié)體積分數至80%，靜置過夜，抽濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味，得水提醇沉上清液，備用。

1.3.2 核苷類成分的含量測定

本試驗采用HPLC同時測定9種核苷類成分的含量[8]，方法如下：色譜柱：Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流動相：甲醇（A）-0.1%乙酸水（B），梯度洗脫：0～8 min，0～2%A；8 min～30 min，2%～6%A；30 min～40 min，6%～10%A；40 min～50 min，10%～30%A；流速：0.5 mL/min；檢測波長：254 nm，進樣體積：10 μL。通過測定四角蛤蜊醇沉上清中核苷類成分，總含量為1.8%，為9種核苷類成分（次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、2-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、2-脫氧肌苷、2-脫氧鳥苷）。

1.3.3 大孔吸附樹脂與陽離子樹脂分離方法比較

大孔樹脂與離子交換樹脂常用于物質的分離純化[9-10]。且大孔樹脂與陽離子交換樹脂具有選擇性好、穩(wěn)定性高、使用周期長等優(yōu)點，本文分別考察了大孔樹脂與陽離子樹脂這兩種不同的分離介質，收集洗脫部位并測定核苷類成分的轉移率和純度。

分別量取SP207、AB-8樹脂各25 mL，用乙醇進行預處理，上樣水提醇沉上清液，用2 BV水進行除雜，再用10 BV 10%乙醇洗脫，收集洗脫部位，測定核苷類成分；分別量取PK228、SK1B樹脂各25 mL，用4%鹽酸與4%氫氧化鈉溶液進行預處理，上樣水提醇沉上清液，用2 BV水進行除雜，再用10 BV 5%氨水溶液洗脫，收集洗脫部位，測定核苷類成分。

1.3.4 大孔吸附樹脂純化工藝考察

準確稱取已預處理的樹脂各5 g（濕重），加入樣品液50 mL，置于搖床上室溫振蕩吸附24 h后，吸取上清液，測定核苷含量，計算吸附率。將以上飽和吸附的樹脂過濾，再加入適量洗脫劑，搖勻，置于搖床上室溫振搖解吸24 h，測定解吸液中核苷的含量，計算解吸率。

式中：Q為飽和吸附量，mg/g；A為吸附率，%；D為解吸率，%；C0為起始質量濃度，mg/mL；C1為平衡質量濃度，mg/mL；C2為解吸后核苷質量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；M為樹脂重量，g。

式中：Cr為洗脫液中核苷的質量濃度，mg/mL；C0為上樣液中核苷的質量濃度，mg/mL；Vr為洗脫液體積，mL；V0為上樣液體積，mL；mr為洗脫液總固含，mg；m0為上樣液總固含，mg。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂與陽離子樹脂分離效果比較

大孔樹脂與陽離子樹脂的分離效果比較見表1。

表1 大孔樹脂與陽離子樹脂的分離效果比較Table 1 Comparison of separation effects of macroporous resin and cation exchange resin

表1顯示，從核苷類成分的純度考察，發(fā)現(xiàn)SP207大孔樹脂的純度最高，達到了16.13%，其次是SK1B陽離子交換樹脂，為10.01%；從回收率考察，SP207大孔樹脂的回收率明顯優(yōu)于其他樹脂，其次仍是SK1B離子交換樹脂。故在第一步純化過程中先采用大孔吸附樹脂，后續(xù)采用陽離子交換樹脂，兩者進行串聯(lián)純化四角蛤蜊醇沉上清中核苷類成分。

2.2 大孔吸附樹脂純化工藝考察

2.2.1 樹脂型號對核苷類成分富集的影響

不同型號大孔樹脂對核苷類成分的靜態(tài)吸附及解吸情況見表2。

表2 不同型號大孔樹脂對核苷類成分的靜態(tài)吸附及解吸情況Table 2 Static adsorption and desorption of nucleosides in different types of macroporous resins

篩選了6種大孔樹脂，分別是SP207、AB-8、HPD100、HPD250、HPD400、HPD500型。其中 SP207 樹脂的吸附率為66.67%，解吸附能力達到87.95%，均明顯優(yōu)于其他大孔樹脂，故選擇SP207型大孔吸附樹脂為純化四角蛤蜊中核苷類成分的樹脂。

2.2.2 上樣濃度對大孔吸附樹脂吸附效果考察

分別加入質量濃度為 50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 mg/mL四角蛤蜊醇沉上清液通過大孔樹脂，測定吸附后的溶液中核苷類成分濃度，計算吸附率，考察不同的上樣濃度對SP207型大孔樹脂吸附效果的影響。上樣濃度對吸附效果的影響見圖1。

圖1 上樣濃度對吸附效果的影響Fig.1 Effect of sample concentration on adsorption

大孔吸附樹脂具有較好的吸附效果，以色散力為主的范德華力吸附極性物質。在一定范圍內，上樣濃度的增大有利于樹脂對極性成分的吸附[11]，充分利用單位體積內的樹脂。如圖1所示，在SP207型大孔樹脂吸附過程中，隨上樣濃度上升，吸附率不斷增大。當濃度為250 mg/mL時，吸附效果最佳，故在上樣液澄清的前提下，選擇較高的質量濃度250 mg/mL進行上樣。

2.2.3 上樣pH值對大孔吸附樹脂吸附效果影響

經測定，四角蛤蜊醇沉上清液的pH值為5.0。上樣液中pH值是影響樹脂吸附效果的因素之一，一般可通過改變pH值，改變物質在溶液中存在的狀態(tài)，從而改善樹脂的吸附率。分別用鹽酸和氫氧化鈉調節(jié)上樣液 pH 值為 3.0、4.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以相同流速通過層析柱，測定吸附后溶液中核苷的濃度，計算吸附率。上樣pH值對吸附效果的影響見圖2。

圖2 上樣pH值對吸附效果的影響Fig.2 Effect of sample pH on adsorption

圖2考察了從酸性到堿性的區(qū)間，不同上樣pH值對SP207樹脂吸附效果的影響。整體而言，上樣pH值為酸性時，樹脂的吸附效果明顯優(yōu)于堿性條件。在SP207樹脂吸附過程中，pH 5.0吸附效果最佳，也就是醇沉上清原本的pH值，故不調節(jié)上樣pH值，直接以“2.1”項下制備的醇沉上清液進行上樣。

2.2.4 水洗量對大孔吸附樹脂洗脫效果影響

四角蛤蜊醇沉上清液中除了核苷類成分，還含有氨基酸、寡糖、寡肽及少量鹽分[5]。在大孔樹脂的純化過程中，需用少量水洗去雜質。上樣液經樹脂吸附后，用不同柱體積的水（2、3、4、5、6 BV）進行洗脫以除去水溶性的雜質。通過考察最佳水洗量去除雜質的影響，并達到減少目標成分損失的效果。水洗量對洗脫效果的影響見圖3。

圖3 水洗量對洗脫效果的影響Fig.3 Effect of water washing amount on elution result

如圖3所示，隨著水洗倍數的增加，除雜率呈緩慢上升的趨勢，而回收率呈下降趨勢。表明少量的水可除去水溶性的雜質，而水洗體積過多則會導致核苷類成分的損失，故綜合考慮水洗量為3 BV，此時除雜效果與回收率均較好。

2.2.5 洗脫劑濃度對大孔吸附樹脂洗脫效果的影響

核苷類成分極性較大，易溶于稀醇、弱堿水等。用體積分數為0%、5%、10%、20%乙醇作為解吸溶劑進行動態(tài)洗脫，收集洗脫液，HPLC測定核苷濃度，計算回收率及純度。乙醇體積分數對洗脫效果的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分數對洗脫效果的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on elution efficiency

如圖4所示，低濃度的醇能達到較好的解吸效果，隨著乙醇濃度的增大，核苷類成分的純度和回收率均呈先上升后穩(wěn)定的趨勢。試驗表明體積分數5%乙醇洗脫效果最佳，核苷純度為33.32%，回收率為85.50%。綜合考慮工業(yè)生產成本，優(yōu)先選擇體積分數5%乙醇作為大孔吸附樹脂的洗脫劑。

2.3 陽離子樹脂的條件優(yōu)化

2.3.1 陽離子樹脂型號篩選

將上述大孔吸附樹脂的洗脫部位進行適量濃縮，繼 續(xù) 分 別 上 樣 JK008、D113、D001、001*16、001*7、SK1B型陽離子交換樹脂，準確稱取已預處理的樹脂各5 g（濕重），加入樣品液50 mL，置于搖床上室溫振蕩吸附24 h后，過濾，再加入適量洗脫劑，置于搖床上室溫振搖解吸24 h，測定其吸附率與解吸附率。如表3所示。

表3 不同型號陽離子樹脂對核苷類成分的靜態(tài)吸附及解吸情況Table 3 Static adsorption and desorption of nucleosides in different types of cation exchange resins

結果表明強酸性的陽離子交換樹脂的吸附效果明顯優(yōu)于弱酸性樹脂。其中001*7樹脂的吸附率、解吸率均最高。故選擇001*7陽離子交換樹脂與大孔吸附樹脂進行串聯(lián)分離純化貝類中核苷類成分。

2.3.2 上樣濃度對陽離子交換樹脂吸附效果的影響

四角蛤蜊醇沉上清經過大孔樹脂純化后，其洗脫部位進行適量濃縮，制備質量濃度為3.2、6.3、17.1、25.2 mg/mL，分別通過陽離子樹脂，考察吸附率變化。上樣質量濃度對吸附效果的影響見圖5。

圖5 上樣質量濃度對吸附效果的影響Fig.5 Effect of mass concentration of sample on adsorption

如圖5所示，在001*7離子交換樹脂吸附過程中，隨上樣濃度增加，吸附效果呈先上升后下降的趨勢。當濃度為6.3 mg/mL，陽離子交換樹脂對核苷類成分的吸附效果最佳。故第二步001*7離子交換樹脂純化過程中，選擇適宜的上樣質量濃度為6.3 mg/mL。

2.3.3 洗脫流速對陽離子交換樹脂洗脫效果的影響

洗脫流速是影響洗脫效果的因素之一。分別以1、2、3、4 BV/h的流速進行洗脫，收集洗脫液，測定核苷的濃度，計算回收率及純度，考察不同洗脫流速對001*7陽離子樹脂洗脫效果的影響。洗脫流速對洗脫效果的影響見圖6。

圖6 洗脫流速對洗脫效果的影響Fig.6 Effect of elution velocity on elution result

一般情況下，洗脫溶劑在樹脂柱層析中流速越快，溶劑與樹脂吸附交換的時間越少，越少的成分被置換出來，則洗脫回收率降低。由圖6可知，洗脫流速越快，核苷類成分的回收率越低。結果表明當流速為3 BV/h時有較好的洗脫效果，且生產效率較高。故選擇此流速為最佳流速。

2.3.4 洗脫濃度對陽離子交換樹脂洗脫效果的影響

核苷類成分屬于極性大的成分，在低濃度的乙醇及堿性溶劑中溶解度較好。本試驗用不同濃度的乙醇和氨水溶液作為001*7陽離子樹脂的解吸溶劑，考察洗脫濃度對樹脂的解吸效果。

首先，在001*7陽離子樹脂中選擇氨水與乙醇作為洗脫劑，比較洗脫效果，發(fā)現(xiàn)氨水與乙醇兩者混合時，洗脫效果最佳。故進一步對洗脫劑的濃度進行考察，結果見圖7A、圖7B。當氨水∶乙醇（體積比為3∶30）時，核苷類成分的回收率最大，核苷含量最高，故在此條件下富集純化效果最佳。

2.4 工藝驗證

取四角蛤蜊軟體制備醇沉上清液，分別經過大孔吸附樹脂和陽離子交換樹脂的分離純化，得到總核苷類部位。將核苷對照品與純化后部位分別注入高效液相色譜系統(tǒng)進行分析，結果見圖8。

圖7 氨水與乙醇洗脫濃度對洗脫效果的影響Fig.7 Effect of elution concentration of ammonia and ethanol on the elution

試驗采用大孔樹脂與陽離子交換樹脂串聯(lián)來純化四角蛤蜊醇沉上清中核苷類成分。通過動態(tài)吸附、解吸實驗確定最佳工藝條件：第一步純化樹脂型號為SP207型大孔樹脂，質量濃度為250.0 mg/mL，pH值為5.0，體積分數為5%乙醇的洗脫劑，此時核苷質量分數為33.32%，回收率為85.50%。第二步純化的樹脂型號為001*7陽離子樹脂，此時質量濃度6.3 mg/mL，流速3 BV/h，洗脫劑是氨水∶乙醇∶水（體積比3∶30∶67）溶液。經過兩次樹脂純化后質量分數高達50%，提高了26倍多，且總回收率為70.32%。

3 結論

目前，對于富集貝類中核苷類成分的文獻報道較少。本試驗將大孔吸附樹脂與陽離子交換樹脂進行串聯(lián)，純化四角蛤蜊中核苷類成分。核苷類成分極性較大，含有較多的共軛雙鍵，在大孔吸附樹脂的篩選中，結果表明SP207型弱極性的大孔吸附樹脂對核苷類成分吸附效果明顯優(yōu)于極性樹脂，推測其吸附力主要是色散力與分子篩作用；在陽離子交換樹脂的吸附過程中，核苷類成分通過酸性離子鍵的作用進行吸附。

前期對四角蛤蜊醇沉上清中核苷類成分進行了鑒別，發(fā)現(xiàn)其中次黃嘌呤、黃嘌呤、肌苷等嘌呤類的物質較多[8]，這與四角蛤蜊作為海鮮貝類，其生長環(huán)境及攝食藻類有關。HPLC圖結果對比顯示，次黃嘌呤、黃嘌呤、肌苷、鳥苷等堿基與核苷類成分經過兩次樹脂串聯(lián)純化后，其回收率均較高，而其他核苷類成分回收率低，推斷其可能原因是在樹脂上吸附過強，洗脫不完全或在水洗除雜的過程中損失。采用HPLC共檢測9種核苷類成分：次黃嘌呤、黃嘌呤、肌苷、鳥苷、胸腺嘧啶、2-脫氧肌苷、2-脫氧鳥苷。在試驗中發(fā)現(xiàn)該純化部位還含有核苷酸類成分，如腺苷酸（AMP）、肌苷酸（IMP）等。

圖8 核苷類成分混合標準品HPLC圖（A）及未純化（B）、純化HPLC圖（C）Fig.8 HPLC chromatograms of Mixed standards（A）and unpurified（B），purification（C）

通過工藝放大驗證，結果表明本試驗的純化方法較好地富集了四角蛤蜊醇沉上清中核苷及核苷酸類成分，且該工藝可操作性強，生產周期短，成本低，環(huán)保性強，制備純度較高天然核苷類成分，為后續(xù)進一步開發(fā)貝類核苷類成分提供了理論基礎。

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Purification of Nucleosides and Nucleobases from Mactra veneriformis

ZHANG Qian1，2，LIU Rui1，2，3，CHENG Jian-ming1，2，3，WANG Xin-zhi1，2，3，DU Jun-chao1，2，ZHANG Wen-ying1，2，WU Hao1，2，3，*
（1.College of Pharmacology，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，Jiangsu，China；2.Jiangsu Key Laboratory of Research and Development in Marine Bio-resource Pharmaceutics，Nanjing 210023，Jiangsu，China；3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine，Nanjing 210023，Jiangsu，China）

The nucleosides were purified by macroporous adsorption resin and cation exchange resin from Mactra veneriformis，the purity and recovery rate of nucleosides were determined.The influence of the resin model，sample concentration，washing volume，concentration and flow rate on the purification efficiency were investigated in order to obtain the best purification process.The type and optimum process of macroporous resin was SP207，sample concentration was 250 mg/mL，pH value was 5.0，removal of impurities with water was 3 BV，and the eluent was the ethanol of 5%volume fraction.While the further purification of ion exchange resin determined that the resin type and the best purification process was to use 001*7 cation exchange resin，sample concentration was 6.3 mg/mL，elution solution was prepared with ammonia，ethanol and water（the volume ratio was 3∶30），elution flow rate was 3 BV/h.After tandem and purification of the two resins，the nucleosides in the alcohol precipitation supernatant of mactra quadrangularis were increased from 1.80%to 50.6%，with a total recovery of 70.32%.The process validation showed that the way to use SP207 macroporous resin and 001*7 cation exchange resin to purify nucleosides was stable and feasible，which could be adopted in the separation and purification of nucleosides in Mactra veneriformis.

Mactra veneriformis；nucleosides；macroporous resin；cation exchange resin；purification

2016-12-15

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.007

國家公益性行業(yè)專項基金（201305007、201405017）；國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）；江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程項目（PAPD）；江蘇省青藍工程（2016）

張倩（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：海洋藥物研究。

*通信作者：吳皓（1957—），女，教授，研究方向：海洋藥物及中藥炮制學研究。