姜 一，張 琳，王仲敏

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津 300456； 2.沈陽(yáng)市第一私立高級(jí)中學(xué)，遼寧 沈陽(yáng)110043）

鵝絨藤葉斑病兩種致病菌的鑒定*

姜 一1，張 琳2，王仲敏1

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津 300456； 2.沈陽(yáng)市第一私立高級(jí)中學(xué)，遼寧 沈陽(yáng)110043）

鵝絨藤（Cynanchum chinense R.Br.）是一種很有開(kāi)發(fā)價(jià)值的野生藥用植物資源，其汁液具有抗腫瘤等多種功效，但其栽培中易發(fā)生葉斑病。從鵝絨藤感病葉片中單斑分離出2株真菌，P1單斑分離率為68.18%、P2為6.82%，侵染試驗(yàn)證明二者均具侵染性；形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定證明，P1為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、P2為球黑孢（Nigrospora sphaerica）。P1菌絲在15～30℃下能生長(zhǎng)但最適為24℃、致死為63℃，最適pH為7，最適濕度為50%，菌絲適宜全黑暗下生長(zhǎng)；蔗糖是最適碳源、尿素是最適氮源、NaH2PO4是最適無(wú)機(jī)鹽、維生素B1是最適生長(zhǎng)因子；培養(yǎng)2～3 d為菌絲速長(zhǎng)期，第5天可見(jiàn)菌核產(chǎn)生，未見(jiàn)孢子產(chǎn)生。P2菌絲在5～35℃下能生長(zhǎng)但最適為24℃、致死為68℃，最適pH為8，最適濕度為90%，菌絲生長(zhǎng)宜黑暗條件；D-果糖為最適碳源、酵母膏為最適氮源、K2HPO4為最適無(wú)機(jī)鹽、萘乙酸為最適生長(zhǎng)因子；培養(yǎng)2～3 d為菌絲速長(zhǎng)期，第4天可見(jiàn)孢子產(chǎn)生，在15～35℃能產(chǎn)孢但最適為24℃，孢子萌發(fā)最適溫度為25℃、最適pH為8、最適濕度為90%、光照利產(chǎn)孢但黑暗宜孢子萌發(fā)。

鵝絨藤；立枯絲核菌；球黑孢

鵝絨藤（Cynanchum chinenseR.Br.）是多年生草本植物，屬于蘿藦科（Asclepiadacea）鵝絨藤屬（Cynanchum）。全世界約有鵝絨藤屬植物200多種、我國(guó)約57種，遼寧等眾多省份都有分布，多生長(zhǎng)于荒郊野嶺等非農(nóng)用耕地上［1］。鵝絨藤全草含有甾體、生物堿、氨基酸、蛋白質(zhì)、糖及糖苷、鵝絨藤酯等多種成分［2，3］，可從中分離到蛋白酶、黃酮甙類(lèi)化合物、萜酯及有機(jī)酸，可純化出巰基蛋白酶［4，5］。作為民間藥材，鵝絨藤很早就被我國(guó)使用，因其全草味苦、性涼，可用于去火、止瀉；根和乳汁可用于根治風(fēng)濕痛、腰痛、胃痛等；乳汁可外用，治療疣贅和甲癬等［6］。鵝絨藤生物總堿（CCTA）是許多藥用植物的有效成份，具有免疫調(diào)節(jié)作用和多種生物活性，可殺菌抑毒、抗腫瘤［7］。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，自然生境下的鵝絨藤植株，葉斑病發(fā)生嚴(yán)重，但前人對(duì)鵝絨藤的研究，多關(guān)注化學(xué)成分、藥理藥效等藥用價(jià)值，而有關(guān)其病害、病原菌研究鮮有報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鵝絨藤（Cynanchum chinenseR.Br.）葉斑病感病植株與健康植株，采自大連市甘井子區(qū)；病原菌形態(tài)學(xué)鑒定采用PDA培養(yǎng)基；分子生物學(xué)鑒定使用的試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTP等購(gòu)于大連寶生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離純化

采用單斑和單孢分離法［8］。

1.2.2 病原菌鑒定

將單孢分離純化的菌株接種于PDA平板上，培養(yǎng)5 d后依據(jù)菌落和菌體形態(tài)，進(jìn)行形態(tài)學(xué)的初步鑒定［9］；再依據(jù)真菌的 rDNA-ITS區(qū)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物ITS1和ITS4，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定［10］；PCR產(chǎn)物測(cè)序，交由上海生工完成；使用BLAST和MEGA 5.1軟件，將測(cè)得的菌株ITS序列，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)及序列分析；采用鄰接法（M-E）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及同源性分析，最終確定病原菌的分類(lèi)地位。

1.2.3 致病性測(cè)定

采用針刺接種法。健康葉片接種P1、P2、P1和P2混合液，28℃保濕培養(yǎng)，接種發(fā)病后再行單斑分離鑒定，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。3次重復(fù)［8］。

1.2.4 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

培養(yǎng)基采用PDA平板，測(cè)量菌落大小以十字交叉法；計(jì)算產(chǎn)孢量以血球計(jì)數(shù)板法；孢子保濕培養(yǎng)以玻片懸滴法；濕度測(cè)定以小容器空氣濕度調(diào)節(jié)法，測(cè)定溫、濕度的梯度為5、pH范圍為4～12［8］；最適碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子的篩選，參照張琳論文方法［1］。實(shí)驗(yàn)均3次重復(fù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 鵝絨藤葉斑病癥狀

病害癥狀如圖1所示，主要發(fā)病部位為葉片。初期，病葉感病部位褪綠、逐漸形成橢圓形或不規(guī)則形的枯斑；枯斑中心灰色、斑周?chē)詈稚?，?yán)重者形成穿孔；病斑無(wú)綸紋、分布無(wú)規(guī)則，病情嚴(yán)重的整葉枯死。

2.2 病原菌的分離

從鵝絨藤葉斑病的感病葉片中共分離出4株真菌，分別命名為P1、P2、P3和P4，其單斑分離率分別為68.18%、6.82%、6.82%和6.82%；對(duì)照健康組葉片均無(wú)真菌菌落生長(zhǎng)。

2.3 病原菌的致病性檢測(cè)

針刺法接種、保濕培養(yǎng)2 d后，觀察接種葉感病癥狀、調(diào)查發(fā)病率，結(jié)果如表1。P1與P2無(wú)論是單獨(dú)接種或是混合接種，均可導(dǎo)致葉片發(fā)病，混合接種的發(fā)病率高于單菌株接種，由此認(rèn)為，鵝絨藤葉斑病的主要致病菌是P1，且由P1與P2混合侵染所致；P3和P4的接種葉片均不發(fā)病，因此說(shuō)他們不是鵝絨藤葉斑病的致病菌。

2.4 病原菌鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。P1：菌落正反面均灰白色，松散、絨毛狀，無(wú)波紋，不產(chǎn)孢子。菌絲淺褐色或深褐色，分枝、有隔膜，分枝角度始近直角后為銳角，且分枝菌絲在發(fā)生點(diǎn)縊縮并形成隔膜；能形成菌核但無(wú)孢子產(chǎn)生。依此特征初步判斷P1為絲核菌屬、多核絲核菌群的立枯絲核菌［9，10］。

P2：菌落正面白色、絮狀、有波紋，反面淡黃色；產(chǎn)孢細(xì)胞近球形、無(wú)色；分生孢子梗聚生、無(wú)分枝、淡褐色，具1～2個(gè)隔膜，直形或微彎，頂端細(xì)胞膨大；分生孢子單生于頂端，球形或扁球形、黑褐色、光滑，直徑30～40 um。依此特征初步認(rèn)為P2菌為球黑孢霉菌屬的球黑孢［9］。

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

提取單孢純化的P1和P2的DNA，以真菌通用引物（ITS1和ITS4）進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物純化、測(cè)序，獲得兩株菌的rDNA-ITS堿基序列；再進(jìn)行Blast比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)同源性分析，其結(jié)果表明：致病菌P1屬于立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），P2屬于黑孢霉屬球黑孢（Nigrospora sphaerica）。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)一步確證了形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果的正確。

2.5 兩種致病菌的生物學(xué)特性比較

2.5.1 溫度、pH、濕度、光照、培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)的影響

溫度的影響：P1菌絲最適生長(zhǎng)溫度為24℃、致死溫度為63℃，菌絲在15～35℃范圍內(nèi)能生長(zhǎng)但不產(chǎn)孢，低于10℃不生長(zhǎng)、低于15℃或高于28℃生長(zhǎng)不良。P2菌絲最適生長(zhǎng)溫度為24℃、致死溫度為68℃，菌絲在5～35℃范圍內(nèi)能生長(zhǎng)，低于15℃或高于30℃生長(zhǎng)不良；最適產(chǎn)孢溫度為24℃，在15～30℃范圍內(nèi)均能產(chǎn)孢，孢子致死溫度為70℃；P2孢子培養(yǎng)8 h以上才可萌發(fā)，最適萌發(fā)溫度為25℃、低于15℃孢子不萌發(fā)，在培養(yǎng)8～24 h內(nèi)孢子萌發(fā)率高。

pH的影響：兩種菌在pH為4～10的條件下均能生長(zhǎng)，但P1菌絲生長(zhǎng)的最適pH為7，而P2菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的最適pH均為8；P2孢子在pH為4～6范圍內(nèi)均不萌發(fā)。

濕度的影響：P1適宜低濕環(huán)境，其菌絲最適生長(zhǎng)濕度為50%；P2適宜高濕環(huán)境，其菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的最適濕度為90%，孢子在濕度為30～90%可萌發(fā)，濕度低于50%則不產(chǎn)孢。

光照的影響：全黑暗利于P1和P2的菌絲生長(zhǎng)，但全光照利于P2產(chǎn)孢；P2孢子在全光照、全黑暗、12 h光照、12 h黑暗交替條件下均可萌發(fā)，但全黑暗更宜孢子萌發(fā)。

培養(yǎng)時(shí)間的影響：培養(yǎng)第3天，調(diào)查了二者的菌落直徑和生長(zhǎng)速率，P1的為3.137 cm和1.197，而P2為4.109 cm和1.528，二者比較P2比P1菌落直徑大、生長(zhǎng)速率高。培養(yǎng)第4天時(shí)P2開(kāi)始產(chǎn)孢，但此時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率變緩；第6天時(shí)P1菌絲生長(zhǎng)速度變緩，但未見(jiàn)孢子產(chǎn)生，可見(jiàn)菌核產(chǎn)生。P2孢子在全黑暗條件下培養(yǎng)8～24 h萌發(fā)。

2.5.2 最適營(yíng)養(yǎng)源

經(jīng)篩選，P1菌絲生長(zhǎng)的最適碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子分別是：蔗糖、尿素、NaH2PO4和維生素B1。P2菌絲生長(zhǎng)的最適碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子分別是：D-果糖、酵母膏、K2HPO4和萘乙酸；P2產(chǎn)孢的最適碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子分別是：蔗糖、酵母膏、CaCl2和維生素B2。

圖1 鵝絨藤葉斑病癥狀（健葉片與病葉片）Figure 1 The Cynanchum chinense R．Br．leaf spot’s sym ptom s

表1 鵝絨藤葉斑病分離菌株的致病性檢測(cè)Table 1 The Pathogenic detection of the fungi separated from the Cynanchum chinense R．Br．leaf spot

圖2 病原菌菌落正反面形態(tài)（①為P1，②為P2）Figure 2 The purified four fungal colonies front and back

圖3 P1和P2的菌絲及孢子形態(tài)（①為P1，②為P2）Figure 3 Hyphae and spores of P1 and P2

3 討論

鵝絨藤體內(nèi)含有多種活性成分，具有較高的藥用價(jià)值，作為一種野生植物資源，值得深入研究和開(kāi)發(fā)，但目前有關(guān)其病原菌等研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。文中以形態(tài)學(xué)鑒定法及分子生物學(xué)鑒定法，查明了引起鵝絨藤葉斑病的病原菌是立枯絲核菌Rhizoctonia solani（P1）和球黑孢Nigrosporasphaerica（P2）。立枯絲核菌是常見(jiàn)的土壤真菌，可引起水稻等糧食作物、花生等經(jīng)濟(jì)作物、蘋(píng)果等果樹(shù)、白菜等蔬菜多種植物病害［11，12］。球黑孢在土壤及腐爛植物種子上分布廣泛，可導(dǎo)致麥和草坪枯萎病、玉米軸裂病、狗牙草和竹子葉斑病、柏樹(shù)枯死等多種病害［13～16］。分離出的兩種病原菌中的立枯絲核菌分離率較高，為68.16%，而球黑孢菌分離率較低為6.82%，但二者都具有致病性，由此認(rèn)為立枯絲核菌是鵝絨藤葉斑病的主要致病菌。生物學(xué)特性表明，立枯絲核菌不耐熱、喜干，對(duì)于濕熱環(huán)境的適應(yīng)能力較弱，而球黑孢菌耐熱、喜濕，適應(yīng)能力較強(qiáng)。鵝絨藤葉斑病發(fā)病期為6月中旬，此時(shí)的溫、濕度不高，比較適宜絲核菌的侵染和生長(zhǎng)，而8～9月的氣溫較高且較濕潤(rùn)，利于球黑孢的生長(zhǎng)。二者的生物學(xué)特性可以作為栽培防病的參考。

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Two Kinds of Pathogen Identification of Cynanchum Chinense R.Br.Leaf Spot Disease

JIANG Yi1，ZHANG Lin2，WANG Zhong-min1
（1．Animal＆Plant＆Foodstuffs Inspection Center，Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjn 300456； 2．Shenyang NO．1 Private Middle School，Shenyang，Liaoning 110043）

Ofwild drugs，theCynanchum chinenseR.Br.has great development potential on the research.The extracts of its juice can resist tumor.But the Cynanchum chinenseR.Br.easily has leaf spot disease in grows.Two fungiwhich separated from the leaves infected leaf spot was named P1 and P2.The single spot separation rate of them are 68.18%and 6.82%.Both of them have infection is proved by the infection experiments.The P1 is proved to beRhizoctonia solaniand the P2 isNigrospora sphaericaby themolecular biology techniques and themorphological observations.P1：Mycelia can grow from 15℃to 30℃，but the 24℃was the optimum growth temperature，and the 63℃ is its lethal temperature.The optimum pH is 7 and the optimum humidity is 50%.Themycelial will grow well if the environment is dark.The optimum carbon source was sucrose，the nitrogen source is urea，the NaH2PO4is themost suitable inorganic salt，and the vitamin B1 is the optimum growth factor.Mycelia rapid growth period is about 2～3 d.After five days，the sclerotinia sclerotiorum can be found，but the spore can’t be found.P2：Mycelia can grow from 5℃ to 30℃；the optimum growth temperature was 24℃，68℃ is the lethal temperature，and the optimum pH is 8，the optimum humidity is 90%.Themycelial grow wellwhen the environment is dark，the D-fructosewas the optimum carbon source；the nitrogen source is yeast，and the K2HPO4was themost suitable inorganic salt，and the optimum growth factor is naphthyl acetic acid.Mycelia rapid growth period is about 2～3 d，the spore can be found after four days.The spore of the P2 can sporulated in 15～35℃，the optimal sporulation temperature is 24℃，and the spore germination optimum temperature is 25℃，pH 8 is the optimum pH，the optimum humidity is90%.The sporeswill bemake in Lightenvironmentbut dark environment is suitable for spore germination.

Cynanchum chinenseR.Br.；Rhizoctonia solani；Nigrospora sphaerica

Q939；S41

A

1002－1728（2017）04－0015－04 doi：10.3969／j.issn.1002－1728.2017.04.004

2017－04－19

天津出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（tk001-2016）

姜一（1984－），女，黑龍江齊齊哈爾人，從事植物病理學(xué)研究。