褚文珂，謝蔚鵬，黃 媛，陳 敏

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州310036)

一株異養(yǎng)硝化細菌TT1的分離鑒定及其硝化特性

褚文珂，謝蔚鵬，黃 媛，陳 敏

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州310036)

利用富集培養(yǎng)和平板分離的方法，從西溪濕地土壤中分離得到一株高效異養(yǎng)硝化細菌TT1．通過形態(tài)觀察、生理生化反應以及16S rRNA基因序列分析，鑒定該菌株為假單胞菌屬(Pseudomonas)．硝化特性研究結果表明，碳源、C/N、溫度等因素均對氨氮去除有較大的影響．在乙酸鈉為碳源、C/N為11、轉速140 r/min、pH 7～9及溫度35 ℃時脫氮效果最佳，24 h的氨氮去除率為100%．

異養(yǎng)硝化細菌；鑒定；16S rRNA；硝化作用

隨著工農業(yè)生產的發(fā)展，我國污水的排放總量不斷增加，其中的氮素是造成水體污染的主要原因之一．目前，含氮污水的處理技術可分物化法和生物脫氮法，前者因需要增加設備投資，且操作復雜，對有機物無法同時去除，還會帶來二次污染等問題，在實際運用中受到一定的局限．生物脫氮法以其操作簡單、成本低、不易造成環(huán)境污染、除氮效果較好等多方面的優(yōu)點，被公認為是最有發(fā)展前途的方法[1]．

生物脫氮傳統(tǒng)理論認為脫氮包括好氧硝化和缺氧反硝化兩個過程，且自養(yǎng)型硝化細菌在硝化作用過程中占據主要地位．但近年來的許多研究發(fā)現(xiàn)，一些異養(yǎng)細菌也能進行硝化作用，包括糞產堿菌(Alcaligenesfaecalis)[2], 乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)[3],木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)[4]等．與自養(yǎng)硝化細菌相比，異養(yǎng)硝化菌具有生長速率快、對環(huán)境適應能力強等優(yōu)點[5]．本研究以杭州西溪國家濕地公園中的土壤細菌為研究對象，分離篩選出能高效脫氮的異養(yǎng)硝化細菌，旨在為高效異養(yǎng)硝化菌處理污染廢水提供理論參考．

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

土壤樣品采自杭州西溪國家濕地公園．取表層土壤(0～10 cm)，4 ℃冰箱保存，用于富集分離．

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：檸檬酸三鈉9.0 g/L、(NH4)2SO42.0 g/L、NaNO22.0 g/L、NaCl 1.0 g/L、FeSO4·7H2O 0.4 g/L、K2HPO41.0 g/L、KH2PO40.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.3．

分離培養(yǎng)基：氮源僅加(NH4)2SO4，瓊脂粉20.0 g，其余成分同富集培養(yǎng)基．

異養(yǎng)硝化菌培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g/L、NaNO20.5 g/L、乙酸鈉7.5 g/L、維式鹽50.0 mL，pH 7.0．維式鹽溶液：K2HPO45.0 g/L，MgSO4· 7H2O 2.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.05 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L．

1.3 細菌分離

取10 g土壤樣品加入100 mL富集培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)．取富集培養(yǎng)液適當稀釋后接種于分離培養(yǎng)基平板上，30 ℃下培養(yǎng)1 d，待形成菌落后挑取單菌落，在平板上劃線分離純化，4 ℃斜面保存．

1.4 異養(yǎng)硝化細菌篩選

將上述分離得到的菌株接種到富集培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)24 h，5000 r/min離心10 min，棄上清，再用0.85%生理鹽水洗滌沉淀，再次離心，如此重復3次，以去除菌體培養(yǎng)過程中產生的無機氮素，最后用0.85%生理鹽水制備菌懸液，按1%接種到異養(yǎng)硝化細菌培養(yǎng)基中，置于30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)48 h．取1 mL培養(yǎng)液，加入少量奈斯勒試劑，混勻后觀察顏色變化．若培養(yǎng)液中銨離子濃度高，會呈現(xiàn)黃色或棕色；反之，無色．取上述呈現(xiàn)無色的培養(yǎng)液20 mL，于3000 r/min離心10 min，測定上清液中的氨氮含量，未接種的培養(yǎng)基為對照，計算脫氮率，選取脫氮效果最好的菌株．

1.5 細菌鑒定

1.5.1 形態(tài)和生理生化實驗

菌株的形態(tài)觀察和生理生化實驗根據《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]進行．

1.5.2 16S rRNA序列分析

提取基因組DNA，以基因組DNA為模板擴增．采用細菌通用引物進行菌株16S rDNA基因的V3、V4可變區(qū)擴增．細菌通用引物，正向引物為：22F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’；反向引物為1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’．PCR反應體系(25 μL)為：ddH2O 15.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mm MgCl21.5 μL，2.5 mm dNTPs 2.0 μL，引物27F和1492R各0.5 μL，Taq 聚合酶 0.25 μL，模板DNA 2.5 μL．將PCR產物送上海英駿生物公司測序．

測序所得序列用Blast搜索相似性較高的模式菌株及其16S rRNA基因序列，并應用MEGA 6.06軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹．

1.6 異養(yǎng)硝化活性測定

菌株接種到100 mL異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，置于30 ℃，160 r/min恒溫搖床培養(yǎng)．每隔4 h取樣測定培養(yǎng)液的OD600以及上清液中的NH4+-N 、NO3--N和NO2--N的含量．

1.7 脫氮特性研究

1.7.1 碳源對菌株脫氮的影響

在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中分別添加乙酸鈉、丁二酸鈉、葡萄糖和檸檬酸三鈉作為碳源，并使培養(yǎng)基的C/N都達到 11，其余成分均相同．取菌懸液1 mL，分別接種到100 mL不同碳源的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后檢測培養(yǎng)液的NH4+-N濃度以及OD600．

1.7.2 C/N對脫氮效果的影響

根據上述結果選取最佳碳源，設置C/N分別為9、11、13、15、17，其余步驟同1.7.1．

1.7.3 pH對脫氮效果的影響

在上述最佳碳源、C/N條件下，用HCl和NaOH溶液將異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基pH分別調為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，其余步驟同1.7.1．

1.7.4 溫度對脫氮效果的影響

在上述最佳碳源、C/N和pH條件下，設置溫度梯度為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，其余步驟同1.7.1．

1.7.5 溶氧量對脫氮效果的影響：

在上述最佳碳源、C/N、pH和溫度條件下，通過改變搖床轉速來改變培養(yǎng)基的溶氧量．轉速分別設為120、140、160、180和200 r/min．其余步驟同1.7.1．

1.8 分析方法

NH4+-N的測定采用納氏試劑分光光度法；NO2--N的測定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法；NO3--N的測定采用紫外分光光度法；菌體生長的測定采用濁度法(OD600)；pH值的測定采用pH計[7]．

降解率計算公式：η=(C1-C2)/C1，式中η為NH4+-N、NO2--N和NO3--N的降解率；C1、C2分別為未接種的對照組和接種的實驗組NH4+-N、NO2--N和NO3--N的濃度，單位mg/L．

2 結果與分析

2.1 菌株的形態(tài)鑒定

通過富集分離，篩選得到1株高效異養(yǎng)硝化細菌，編號為TT1．菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陰性．菌落呈黃色，表面光滑，濕潤，不透明，邊緣形狀不規(guī)則．菌株的生理生化特性見表1．

表1 菌株TT1的生理生化特性

注：“+”陽性；“-”陰性；“ND”不確定.

2.2 16S rRNA基因序列分析

菌株TT1的16S rRNA序列在GenBank的登錄號為KY178286，經BLAST與數(shù)據庫中的基因序列進行比較，發(fā)現(xiàn)TT1與假單胞菌屬(Pseudomonas)的多個菌株同源性達99.9%．從GenBank中取得相關序列作為參考序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示．結合菌株的形態(tài)學、生理生化特性和16S rRNA基因測序，初步鑒定菌株TT1屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)．

圖1 基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence homology

2.3 菌株TT1的生長曲線和脫氮特性

在異養(yǎng)硝化細菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)TT1菌株，觀察其生長過程及培養(yǎng)基pH的變化．如圖2所示，在培養(yǎng)最初8 h內細菌增殖速率緩慢；在8 h后，迅速進入對數(shù)生長期，并在28 h左右到達穩(wěn)定期，OD600值達到最高．同時隨著細菌的生長，培養(yǎng)液的pH值也隨之增高，由起始時的7.0上升到最高時的8.8．

圖2 菌株TT1的生長曲線和pH值變化Fig.2 Growth curve of strain TT1 and the changes of pH during cultivation

圖3 菌株TT1的異養(yǎng)硝化過程Fig.3 Heterotrophic nitrification process of strain TT1

脫氮特性研究結果(圖3)顯示，NH4+-N和NO2--N在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期初期去除速率最快，28 h氨氮的去除率達到86.8%，亞硝酸鹽氮去除率達到99.3%，且在降解過程中沒有檢測到硝酸鹽氮的積累，可能是因為TT1菌株同時具有好氧反硝化的功能，能將硝態(tài)氮分解為N2O、N2等氣體而去除．相關特性有待進一步研究．

2.4 環(huán)境條件對TT1菌株脫氮的影響

2.4.1 碳源對脫氮效果的影響

將菌株TT1接入不同碳源的異氧硝化培養(yǎng)基中，經過24 h的培養(yǎng)后，檢測培養(yǎng)液的NH4+-N濃度．結果顯示：以乙酸鈉為碳源時，NH4+-N去除率最高，為93.4%；其次是檸檬酸三鈉為碳源，NH4+-N去除率為79.6%；葡萄糖為碳源時，NH4+-N去除率最低，只有31%．從細菌生長來看，檸檬酸三鈉為碳源時生長量最高，其次是乙酸鈉，說明細菌的生長量和氨氮去除率之間并非始終是平行關系，從脫氮效果來看，最佳碳源應該是乙酸鈉．

圖4 碳源種類對菌株TT1生長及NH4+-N去除率的影響Fig.4 Effect of carbon source on growth and NH4+-N degradation rate of strain TT1

圖5 C/N比對菌株TT1生長及NH4+-N去除率的影響Fig.5 Effect of C/N ratio on growth and NH4+-N degradation rate of strain TT1

2.4.2 C/N對脫氮效果的影響

如圖5所示，在C/N為9時，其NH4+-N去除率為88.4%；C/N為11、13、15、17時，NH4+-N去除率均達到100%．從細菌生長量來看，不同的C/N的培養(yǎng)基中的OD600都較高，都在1.5以上，其中C/N為13的OD600值最高為1.80．綜合考慮成本等因素，建議培養(yǎng)基的C/N 為11較好．

2.4.3 溫度對脫氮效果的影響

設置不同培養(yǎng)溫度，24 h后氨氮去除率試驗結果(圖6)表明，當溫度在35 ℃以下，菌株生物量和NH4+-N去除率隨溫度的升高而增大，在35 ℃時達到最大值．這與Mahendrappa等[10]對美國南部的土壤硝化作用的研究相似，其硝化作用的最適溫度為35 ℃．但是當溫度達到40 ℃時，菌株生物量和NH4+-N去除率明顯下降，表明該菌株不耐高溫．同時異氧硝化菌的適宜溫度范圍可能因不同溫度帶濕地土壤的環(huán)境而有所不同．

圖6 溫度對菌株TT1生長及NH4+-N去除率的影響Fig.6 Effect of temperature on growth and NH4+-N degradation rate of strain TT1

圖7 pH對菌株TT1生長及NH4+-N去除率的影響Fig.7 Effect of pH on growth and NH4+-N degradation rate of strain TT1

圖8 轉速對菌株TT1生長及NH4+-N去除率的影響Fig.8 Effect of shaking speed on growth and NH4+-N degradation rate of strain TT1

2.4.4 pH對脫氮效果的影響

pH對脫氮效果的影響如圖7所示，在pH 7～9范圍內，菌株TT1的氨氮去除率都接近100%，但是pH為9時，生長呈下降趨勢．而pH為5和6時，菌株TT1基本不生長，其氨氮去除為零．因此，菌株脫氮的最適pH為7～9．

2.4.5 溶氧量對脫氮效果的影響

通過改變搖床轉速來改變培養(yǎng)基中的溶氧量，如圖8所示，結果表明，在140～200 r/min的范圍內，菌株的生長量和氨氮去除率均可達到最高．因此轉速為140 r/min比較適宜．

3 討 論

自20世紀80年代以來，國內外的研究發(fā)現(xiàn)，某些假單胞菌例如Peseudomonasflurescens和Pseudomonasaeruginos等具有異養(yǎng)硝化的功能[8-9]．不僅如此，研究者還發(fā)現(xiàn)很多具有異養(yǎng)硝化功能的細菌同時具有好氧反硝化的功能，能將氨態(tài)氮最終轉化為可以逸出的氣態(tài)氮而將其去除[10-11]．很多研究表明，同步異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細菌在有機物的去除及脫氮效率方面比傳統(tǒng)脫氮菌更勝一籌[12]．

從TT1菌株脫氮特性的初步研究結果來看，該菌株具有生長快、高效脫氮的特點．在硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h左右進入對數(shù)期，OD600最大可達1.8．在乙酸鈉為碳源、C/N為11、轉速140 r/min、pH 7～9及溫度35 ℃時脫氮效果最佳，24 h的氨氮去除率為100%．同時，通過對硝化反應過程中硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的含量測定發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮幾乎沒有積累．據此推測，該菌株還可能同時具有較高的好養(yǎng)反硝化能力，相關特性有待進一步研究．

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Isolation，Identification and Nitrifying Characterization of a Heterotrophic Nitrifying Bacterium TT1

CHU Wenke, XIE Weipeng, HUANG Yuan, CHEN Min

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

A high efficiency heterotrophic nitrifying bacterium TT1 was isolated from the soil of Xixi Wetland by enrichment culture and plate separation. The strain was identified asPseudomonassp. through morphological feature, biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis. The factors including carbon source, C/N and cultivation temperature were important for the removal of ammonia nitrogen. The optimum condition for heterotrophic nitrification was as follows, sodium acetate as the carbon source, C/N ratio of 11, shaking speed of 140 r/min, pH of 7-9 and culture temperature of 35 ℃. The removal rate of ammonia nitrogen reached 100% after 24 h cultivation under the optimum condition.

heterotrophic nitrifying bacteria; identification; 16S rRNA; nitrification

2016-12-12

浙江省自然科學基金項目(LY14C010004).

陳 敏(1963—)，女，教授，主要從事環(huán)境微生物研究．E-mail：mchen63@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.04.011

Q938

A

1674-232X(2017)04-0404-06