陳國元，李青松，何彩慶

（廈門理工學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，福建 廈門 361024）

0 引言

近幾十年來，水體富營養(yǎng)化及藻類水華已成為一個世界性環(huán)境問題。水生植物化感抑藻作用的發(fā)現(xiàn)使其開始應(yīng)用于富營養(yǎng)化水體藻類控制領(lǐng)域，并已成為世界環(huán)境研究的熱點和前沿[1]?，F(xiàn)在，許多植物的浸提液和提取物都發(fā)現(xiàn)對藻類生長具有很好的抑制作用[2-5]，并從中分離到具有很好抑藻效果的化感物質(zhì)[6]，為藻類水華控制提供了新的思路和材料。作者在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)具有很好氮、磷去除能力的挺水景觀植物-黃菖蒲(Iris pseudacorus L)[7]能對藻類生長產(chǎn)生嚴(yán)重影響[8]，已從黃菖蒲水浸提液中鑒定出15種脂肪酸類物質(zhì)和9種酚酸類物質(zhì)，并進(jìn)一步研究表明，這些有機酸成分能夠明顯抑制銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)超氧化物歧化酶(SOD)的活性，引起細(xì)胞的氧化損傷，促進(jìn)葉綠素的分解[9]。

本實驗繼續(xù)以黃菖蒲為材料，采用液液萃取的方法得到黃菖蒲水浸提液的有機酸組分，研究其對銅綠微囊藻細(xì)胞質(zhì)膜透性的影響，具體包括細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基(O2-·)的產(chǎn)生，K+、可溶性蛋白及核酸滲出量，非電解質(zhì)外滲率及藻液電導(dǎo)率等，旨在探討黃菖蒲有機酸組分化感作用下，銅綠微囊藻細(xì)胞膜系統(tǒng)的變化，為進(jìn)一步闡明黃菖蒲有機酸組分的化感抑藻機制提供理論依據(jù)，以期最終為將其應(yīng)用到富營養(yǎng)化水體水華防治中提供有價值的研究資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃菖蒲購至福建省龍海市興濤花木專業(yè)合作社。銅綠微囊藻(FACHB-905)由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供，先用BG-11培養(yǎng)液于MGC-450BPY-2智能型光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：恒溫光照(25±1℃，3000lx)，明、暗比 12h/12h。然后取適量藻液，3 000 r/min離心10 min，去掉上清液，獲得銅綠微囊藻細(xì)胞，加入新鮮的高溫滅菌的BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)6d，使之處于對數(shù)生長期。

1.2 有機酸組分的獲得

黃菖蒲洗凈、晾干、粉碎，室溫下60.0 g粉末用1 L超純水浸提48 h，濾紙濾去提取液中的殘渣后經(jīng)0.45 μm Whatman GF/C玻璃纖維膜抽濾，濾液用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值到12，以6 000 r/min離心10 min，上清液移至分液漏斗，色譜純正己烷萃取3次，收集水相用2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至2，乙酸乙酯萃取4次，收集乙酸乙酯組分，無水硫酸鈉干燥，35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，獲得浸膏58.6 mg，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗設(shè)計

分別稱取適量浸膏，加入二甲亞砜（DMSO）溶解，加入高溫滅菌的BG11培養(yǎng)基，使DMSO體積分?jǐn)?shù)為0.05%[10]，隨后接入處于對數(shù)生長期的銅綠微囊藻，接種密度約為5×106個/mL，浸膏最終質(zhì)量濃度分別為2，20和50 mg/L。同時設(shè)定不添加浸膏的BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)銅綠微囊藻為對照組。每組設(shè)定3個平行。培養(yǎng)瓶置于MGC-450BPY-2智能型光照培養(yǎng)箱中。第 1，3，5 天取樣，測定藻液電導(dǎo)率(EC)、非電解質(zhì)外滲量、可溶性蛋白質(zhì)及核酸滲出量和銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)含量。

對K+釋放的影響：首先取適量浸膏，加入DMSO溶解后加入生理鹽水分別配制成質(zhì)量濃度4，40和100 mg/L的浸膏溶液。然后取擴大培養(yǎng)后的銅綠微囊藻，加入高溫滅菌的BG11培養(yǎng)基使銅綠微囊藻密度約為1.0×107個/mL，取藻液10 mL于15 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，去掉上清液，加入10 mL生理鹽水，輕輕搖勻后離心，獲得銅綠微囊藻細(xì)胞，共制備15管。3管中加入10 mL生理鹽水作為對照，其它9管中分別加入5 mL生理鹽水和5 mL浸膏溶液，使有機酸組分質(zhì)量濃度分別為2，20和50 mg/L，搖勻后置于MGC-450BPY-2智能型光照培養(yǎng)箱中，3 d后取樣測定藻液中K+濃度。最后3管加入10 mL生理鹽水,100℃水浴10 min,3 000 r/min離心10 min，上清液用于測定K+濃度,表示細(xì)胞膜完全破壞后K+滲出總量[11]。

1.4 測定方法

取藻液15 mL，3 000 r/min離心10 min后，獲得上清液和藻細(xì)胞。取上清液進(jìn)行下列參數(shù)測定：電導(dǎo)率(EC)采用臺式電導(dǎo)率儀(優(yōu)特CON 510)測定；非電解質(zhì)外滲量采用紫外吸收法[12]，用UV-2550型紫外分光光度計(日本島津)測定,以O(shè)D264值表示；藻可溶性蛋白質(zhì)和核酸滲出量分別用OD280[13]和OD260值[14]表示。藻細(xì)胞中O2-·的產(chǎn)生情況參照蕭華山等[15]的方法測定，以O(shè)D530值表示其相對含量。K+濃度在上清液經(jīng)0.2 μm玻璃纖維濾膜過濾后采用AA-6300C型火焰原子吸收分光光度計(日本島津)測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

運用SPSS10.0軟件及Sigmaplot10.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)O2-·的影響

不同濃度黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)O2-·含量的影響見圖1。

圖1 不同濃度黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)O2-·質(zhì)量濃度的影響

由圖1可知，有機酸質(zhì)量濃度為2 mg/L時，藻細(xì)胞中O2-·含量在培養(yǎng)過程中與對照組沒有顯著性差異（配對t檢驗，p＞0.05）；而有機酸質(zhì)量濃度為20mg/L時，培養(yǎng)第3天，藻細(xì)胞中O2-·含量明顯上升，為初始值的2.38倍，第5天進(jìn)一步增加，為初始值的4.03倍，顯著高于對照組（配對t檢驗，p＜0.05）；有機酸質(zhì)量濃度為50 mg/L時，藻細(xì)胞中含量在培養(yǎng)過程中也是顯著高于對照組（配對t檢驗，p＜0.05），在第3天和第5天分別為初始值的5.06和7.78倍，說明隨著有機酸的增加，培養(yǎng)時間延長，有機酸組分對銅綠微囊藻產(chǎn)生了嚴(yán)重的氧化脅迫。已有大量研究表明，有機酸類物質(zhì)是非常重要的一類化感抑藻物質(zhì)[16-21]。如適量的焦性沒食子酸、乳酸等都能對銅綠微囊藻產(chǎn)生氧化脅迫，導(dǎo)致藻細(xì)胞內(nèi)含量上升[18-19]。而作者在前期研究中，已從黃菖蒲水浸提液中鑒定出15種脂肪酸類物質(zhì)和9種酚酸類物質(zhì)[9]，其中包括了已被證明具有化感抑藻活性的琥珀酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、辛酸、葵酸、月桂酸、軟脂酸、硬脂酸、丁酸、油酸和戊酸等[10,16,22]。這些有機酸類物質(zhì)可引起藻細(xì)胞內(nèi)O2-·的產(chǎn)生，但是濃度較低的時候，自由基的產(chǎn)生與消除之間處于動態(tài)平衡狀態(tài)，而隨著有機酸濃度的增加，培養(yǎng)時間延長，有機酸組分對銅綠微囊藻的氧化脅迫加重，O2-·的產(chǎn)生與清除失去平衡，導(dǎo)致O2-·積累。

2.2 黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻培養(yǎng)液EC及K+滲出的影響

細(xì)胞膜通透性的存在，對細(xì)胞內(nèi)外各種物質(zhì)的交換，滲透壓的維持，胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定等均有著重要的生理意義。脅迫環(huán)境下，細(xì)胞質(zhì)膜一般最先受到破壞，其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)小分子物質(zhì)外滲，EC增加[19,23]。因此，細(xì)胞膜的通透性可以用EC表示，見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度黃菖蒲有機酸對銅綠微囊藻培養(yǎng)液EC的影響

由圖2可知，對照組和有機酸質(zhì)量濃度為2 mg/L組，EC值都略有降低，第5天分別為初始值的83.9%和87.3%。而有機酸質(zhì)量濃度為20 mg/L時，培養(yǎng)第3天，EC值略有上升，為初始值的1.07倍，第5天明顯上升，為初始值的1.26倍；有機酸組分為50 mg/L時，培養(yǎng)第3天，EC值明顯上升，為初始值的1.28倍，第5天繼續(xù)增加，為初始值的1.40倍，這主要是因為，藻細(xì)胞內(nèi)積累的O2-·又可以轉(zhuǎn)化成H2O2和OH·，這些自由基很容易與細(xì)胞膜成分、核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，膜結(jié)構(gòu)受到破壞、膜透性發(fā)生變化[24]。

K+是外滲液中電解質(zhì)的主要成分，因此K+含量可以用來衡量細(xì)胞膜損傷的程度[12],見圖3。

圖3 不同質(zhì)量濃度黃菖蒲有機酸對銅綠微囊藻胞內(nèi)K+釋放的影響

由圖3可知，黃菖蒲有機酸質(zhì)量濃度為2，20和50 mg/L時，藻液中K+質(zhì)量濃度分別為4.73，6.89和9.49 μg/L，分別為對照組的 1.14，1.66 和 2.28 倍，說明高濃度黃菖蒲有機酸組分處理后，銅綠微囊藻細(xì)胞膜的選擇透性被破壞，離子的滲出量大量增加。當(dāng)藻細(xì)胞完全破壞時，藻細(xì)胞中K+全部釋放，質(zhì)量濃度為10.15 μg/L，因此，黃菖蒲有機酸質(zhì)量濃度為50 mg/L時，藻細(xì)胞中K+釋放程度達(dá)到了93.5%，表明，此時銅綠微囊藻細(xì)胞膜的選擇透性已經(jīng)被嚴(yán)重破壞，藻細(xì)胞膜損傷非常嚴(yán)重。李鋒民等[11]研究了2-甲基乙酰乙酸乙酯（EMA）對銅綠微囊藻細(xì)胞膜選擇透性的影響，結(jié)果表明，高濃度(ρ＞1 mg/L)的EMA能顯著增加銅綠微囊藻內(nèi)K+的滲出量。而K+的大量滲出導(dǎo)致藻細(xì)胞內(nèi)K+的缺乏，從而引起細(xì)胞其它生理功能的改變，如胞內(nèi)的離子平衡、光合作用及細(xì)胞生長等[25]，從而惡性循環(huán)，加劇對藻細(xì)胞的傷害。

2.3 黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻OD264的影響

藻的細(xì)胞質(zhì)膜通透性增大的時候，除了電解質(zhì)會滲出外，細(xì)胞內(nèi)有機物也會大量滲出，導(dǎo)致藻培養(yǎng)液中的非電解質(zhì)含量短時間內(nèi)急劇增高[12]。見圖4。

圖4 不同質(zhì)量濃度黃菖蒲有機酸對銅綠微囊藻OD264的影響

由圖4可知,有機酸質(zhì)量濃度為2 mg/L時，在培養(yǎng)過程中藻細(xì)胞OD264與對照組沒有顯著性差異（配對t檢驗，p＞0.05）；而有機酸質(zhì)量濃度為20 mg/L時，培養(yǎng)第3天，藻細(xì)胞OD264明顯上升，為初始值的1.70倍，第5天進(jìn)一步增加，為初始值的2.66倍，顯著高于對照組（配對t檢驗，p＜0.05）；有機酸質(zhì)量濃度為50 mg/L時，藻細(xì)胞OD264在培養(yǎng)過程中也是顯著高于對照組 （配對t檢驗，p＜0.05），在第3天和第5天分別為初始值的3.85和8.04倍。

藻液中蛋白質(zhì)和核酸是非電解質(zhì)外滲物的主要成分，其變化趨勢與OD264變化趨勢基本一致。見圖5和圖6。

圖5 不同質(zhì)量濃度黃菖蒲有機酸對銅綠微囊藻OD280釋放的影響

圖6 不同質(zhì)量濃度黃菖蒲有機酸對銅綠微囊藻OD260釋放的影響

由圖5和圖6可知，有機酸質(zhì)量濃度為2 mg/L時，藻液可溶性蛋白和核酸含量在培養(yǎng)過程中與對照組沒有顯著性差異（配對t檢驗，p＞0.05）；而有機酸質(zhì)量濃度為20 mg/L時，培養(yǎng)第3天，藻液可溶性蛋白和核酸含量輕微增加，分別為初始值的1.35和1.26倍，第5天有較大程度的上升，分別為初始值的1.89和172倍，顯著高于對照組（配對t檢驗，p＜0.05）；有機酸質(zhì)量濃度為50 mg/L時，藻液可溶性蛋白和核酸含量在培養(yǎng)過程中顯著高于對照組（配對t檢驗，p＜0.05）,在第5天分別為初始值的5.15和4.69倍,說明隨著黃菖蒲有機酸組分含量的增加，銅綠微囊藻細(xì)胞受到化感作用增強，細(xì)胞膜通透性增大，胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等有機物向胞外滲出，OD264增加。如加拿大一枝黃花(Solidagocanadensis L)提取物處理后，銅綠微囊藻的非電解質(zhì)外滲率也顯著增加[3]。實驗中，藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸都在第5天爆發(fā)式釋放，而藻液電導(dǎo)率變化相對平緩，這主要是因為，細(xì)胞膜通透性增大的時候，細(xì)胞內(nèi)的K+，PO43+等離子傾向優(yōu)先釋放[26]，而經(jīng)過持續(xù)的化感脅迫，藻細(xì)胞膜受到嚴(yán)重?fù)p傷，通透性進(jìn)一步增大，從而促使胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸開始大量向胞外釋放。

3 結(jié)論

不同質(zhì)量濃度的黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻細(xì)胞膜通透性具有明顯不同的影響。具體結(jié)果為：有機酸質(zhì)量濃度為2 mg/L時對銅綠微囊藻細(xì)胞膜通透性沒有顯著影響，表現(xiàn)為，銅綠微囊藻胞內(nèi)O2-·產(chǎn)生和K+、蛋白質(zhì)及核酸釋放，藻液EC及OD264未發(fā)生明顯變化；而有機酸組分質(zhì)量濃度為20和50 mg/L時，銅綠微囊藻細(xì)胞發(fā)生了嚴(yán)重的氧化損傷，胞內(nèi)O2-·大量累積，膜的選擇透性發(fā)生顯著改變，表現(xiàn)為，K+大量釋放，藻液電導(dǎo)率增加，隨著化感時間的延長，細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重，膜透性進(jìn)一步增加，胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等有機物開始大量滲出。有機酸組分質(zhì)量濃度越高，作用效果越明顯。