王立娜，劉春雨，王 穎，王集會(huì)

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

真菌發(fā)酵虻蟲活性物質(zhì)提取、分離及含量測定

王立娜1，劉春雨1，王 穎1，王集會(huì)2*

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

通過超聲水提法提取發(fā)酵虻蟲干粉中水溶性總蛋白，利用改良Lowry法測定其含量；并采用80%乙醇回流提取的方法提取總黃酮，并通過石油醚、乙酸乙酯分別萃取，同時(shí)通過NaNO2-AlCl3-NaOH比色法測定發(fā)酵虻蟲粉不同極性部位中總黃酮的含量。結(jié)果表明發(fā)酵后虻蟲粉中水溶性總蛋白的平均含量高達(dá)99.3140mg/g，而在醇提物中水部總黃酮含量明顯高于石油醚部和乙酸乙酯部。

發(fā)酵；虻蟲干粉；超聲水提；醇提；含量對(duì)比

虻蟲又稱牛蜢，牛虻，屬虻科昆蟲復(fù)帶虻(Tabanrrs bivittatus Mats)昆蟲的雌性干燥全體。中藥虻蟲是一味傳統(tǒng)的活血散瘀類中藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》[1]記載：“蜚虻味苦微寒，主逐瘀血，破下血積，堅(jiān)痞，癥瘕，寒熱，通利血脈及九竅”。現(xiàn)在主要作為中藥成方制劑如大黃庶蟲丸之原料，治療冠心病，心絞痛[2]等病癥。隨著虻蟲藥用價(jià)值的不斷開發(fā)和研究，有研究發(fā)現(xiàn)虻蟲在抗凝血[3]及抗肝癌[4]方面有較好療效。利用球孢白僵菌(Beauveria bassiana (Bals.) Vuill)作為發(fā)酵菌，虻蟲作為發(fā)酵基質(zhì)，利用基質(zhì)中所含有的豐富的氮源、碳源、微量元素、礦物質(zhì)等真菌生長所需的物質(zhì)，在一定的溫度、濕度、時(shí)間等條件下，經(jīng)過白僵菌、虻蟲中所含有的物質(zhì)的相互作用和一系列的生物轉(zhuǎn)化過程，虻蟲的大蛋白會(huì)被真菌產(chǎn)生的蛋白酶酶解成小分子的具有更強(qiáng)抗腫瘤、抗病毒活性的成分，同時(shí)，白僵菌在生長的過程中也會(huì)產(chǎn)生大量的次生代謝物質(zhì)，其中最具代表性的是黃酮類、聚酮類物質(zhì)，經(jīng)研究表明其具有明顯的抗腫瘤和抗病毒[5]的療效。將發(fā)酵后虻蟲粉的水提液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定，而醇提液則依次通過石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，不同的極性部位分別進(jìn)行總黃酮測定，找出豐度最高的部位為下一步發(fā)酵虻蟲的藥理及臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外對(duì)發(fā)酵虻蟲蛋白質(zhì)和黃酮類化合物的研究未見資料報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(CHENGDU MUST BIO-TECHNOLOGY CO,LTD.)、牛血清蛋白(BSA，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、福林酚(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、酒石酸鉀、無水硫酸銅、氫氧化鈉、碳酸鈉、六水氯化鋁、亞硝酸鈉乙醇、皆為分析純。

1.1.2 儀器

TDZ5-WS臺(tái)式多管低速離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司)；FA1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；UV9100B型可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)； KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵虻蟲粉的制備

精密稱取一定量的虻蟲干粉，滅菌，同時(shí)加入適量的活的球孢白僵菌孢子粉，然后在孢子粉中加入較少量表面活性劑吐溫-80，并按一定比例用滅菌水將其稀釋成含有1×108個(gè)孢子的混懸液，拌勻潤濕，控制溫度25～28℃以及濕度為95%的培養(yǎng)條件下，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵7天左右，等長滿發(fā)酵白色菌絲后即停止發(fā)酵，滅活，冷凍干燥即得發(fā)酵物。

1.2.2 發(fā)酵虻蟲粉中水溶性總蛋白和總黃酮的提取

1.2.2.1 水溶性總蛋白的超聲提取

精密稱取發(fā)酵虻蟲粉1.0000 g至100 mL燒杯中，向燒杯中加入15 mL蒸餾水使其溶解，并超聲提取10 min，濾過，取其上清液，重復(fù)上述步驟兩次,去掉殘?jiān)?。將三次上清液混合轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，混勻，靜置。

1.2.2.2 不同部位的總黃酮提取液的制備

精確稱取發(fā)酵虻蟲粉10.0000 g，按料液比1：25加入定量80 %乙醇，超聲提取20 min后，將溶液倒入500 mL圓底燒瓶中，在80 ℃水溫條件下，回流1.5 h，將黃酮粗提液抽濾，棄去殘?jiān)占癁V液，旋蒸揮去乙醇，濃縮成浸膏，加入浸膏量10倍的蒸餾水混懸，然后加入浸膏料液比1:10的石油醚，萃取3次，靜置分層，收集石油醚部并量取其體積及收集水部，將水部加入相同量的乙酸乙酯，萃取3次，靜置分層，收集乙酸乙酯部量取體積，收集水部，量取其體積。

1.2.3 Lowry法測定發(fā)酵虻蟲粉中水溶性總蛋白含量[6]

1.2.3.1 堿性銅溶液的制備

分別量取0.1mol/L酒石酸鉀溶液與0.04mol/L硫酸銅溶液 0.5 mL，4 %碳酸鈉溶液與溶液各25mL，搖勻，即得，使用時(shí)要現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液的制備

精密稱取0.0200 g牛血清蛋白于燒杯中溶解，移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，靜置，即得200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別用移液槍精密量取標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白質(zhì)溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置于試管中，并編號(hào)，然后補(bǔ)加蒸餾水至1 mL，立即加入堿性銅溶液5 mL，搖勻，室溫放置10 min后，快速加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻后室溫放置30 min，顯色后，以水作空白對(duì)照，并于650 nm波長處測定各樣品吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到直線回歸方程，見圖1。

1.2.3.4 發(fā)酵虻蟲粉中水溶性總蛋白含量的測定

用移液槍吸取2 mL發(fā)酵虻蟲粉水提液于10 mL容量瓶中，定容，搖勻后吸取1 mL置試管中，按照1.2.3.3項(xiàng)下方法，自"加堿性銅溶液5 mL"起，測定其吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品溶液中所含蛋白質(zhì)的質(zhì)量(mg)。分別測量三次，取平均值，見表1。

1.2.4 NaNO2-AlCl3-NaOH比色法測定發(fā)酵虻蟲粉中總黃酮的含量[7]

1.2.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取蘆丁對(duì)照品20 mg，用60 %乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中并定容至刻度，搖勻，即為濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別用移液槍吸取標(biāo)準(zhǔn)液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于10 mL試管中，補(bǔ)加30 %乙醇至5 mL，迅速加入5 %的亞硝酸鈉溶液300 μL，搖勻后靜置6 min；然后加600 μL 10 %的六水氯化鋁溶液，5 min后，加入2 mL 1.0 M的氫氧化鈉溶液，再用30 %乙醇補(bǔ)加至刻度。然后在510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁吸光度(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到直線回歸方程，見圖2。

1.2.4.3 發(fā)酵后虻蟲粉中總黃酮含量的測定

精密吸取不同部位發(fā)酵虻蟲粉黃酮提取液2 mL于試管中,按照1.2.4.2項(xiàng)下方法，自"加30 %乙醇至5 mL"起，依次測定吸光度，通過回歸方程求得待測樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量(M)。分別測量三次，取平均值，見表2。

2 結(jié)果與分析

1.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖1。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2 發(fā)酵虻蟲水溶性蛋白質(zhì)含量如表1。

表1 水溶性蛋白質(zhì)含量 mg/g

1.3 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

圖2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4 不同極性部位黃酮含量

不同極性部位黃酮含量見表2。

表2 不同極性部位黃酮含量 mg/g

水部黃酮含量最高，乙酸乙酯部次之，石油醚部最少，說明不同極性部位總黃酮含量存在差異，其在極性大的水和乙酸乙酯中溶解度較大，而在低極性石油醚中基本不溶解。

3 討論生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是藥性真菌發(fā)酵炮制中藥的最新應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)以中藥虻蟲粉為培養(yǎng)基，添加適量的球孢白僵菌，進(jìn)行發(fā)酵炮制。利用酶強(qiáng)大的分解轉(zhuǎn)化能力，對(duì)虻蟲粉中的蛋白質(zhì)、黃酮加以利用，從而在代謝過程中轉(zhuǎn)化修飾，提高虻蟲粉中活性成分的藥效作用，而且通過本實(shí)驗(yàn)可以得知發(fā)酵后的虻蟲粉中含有大量的蛋白質(zhì)，但是與發(fā)酵前相比蛋白質(zhì)含量是否有所增加，以及對(duì)其活性成分——黃酮在每個(gè)部位的抗腫瘤活性將是我們下一步的研究工作。

[1] 姜 波,趙榮國,高示賢,等.虻蟲的本草考[J].證現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),1992,9(3):112.

[2] 李軍德. 中藥虻蟲研究進(jìn)展[C]// 中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)中藥專業(yè)委員會(huì).2009年全國中藥學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.[出版地不祥]：[出版者不祥], 2009:5.

[3] 梁進(jìn)權(quán),宓穗卿,王寧生.水蛭、虻蟲配伍的抗凝血和抗血小板聚集的作用[J].中藥材,200932(9):1347-1350.

[4] 周志愉,余 功,饒 斌,等.破血逐瘀中藥虻蟲對(duì)荷H22肝癌小鼠內(nèi)皮生長因子及MMP-9蛋白表達(dá)的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016,33(2):224-228.

[5] 蔣 學(xué).白僵蠶活性成分分離純化及其藥理作用的研究[D].杭州：浙江大學(xué),2013.

[6] 王立娜, 馬明珠, 王 穎, 等. 中藥土鱉蟲發(fā)酵前后活性成分的含量對(duì)比[J].湖南中醫(yī)雜志, 2016, 32(8): 200-202.

[7] 王立娜,馬明珠,王集會(huì). 發(fā)酵土鱉蟲總黃酮含量的測定及方法學(xué)考察[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(21):95-97.

(本文文獻(xiàn)格式：王立娜，劉春雨，王 穎.真菌發(fā)酵虻蟲活性物質(zhì)提取、分離及含量測定[J].山東化工，2017，46(06)：82-83，88.)

The Active Ingredients of Extraction, Separation and Determination for the Fermented Tabanid by Fungus

WangLina1,LiuChunyu1,WangYing1,WangJihui2*

(1. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Experiment Center, Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355, China)

To extract the total soluble protein by ultrasonic for the fermented tabanid of fungus . And using the improved Lowry method to determine the content of tabanid . and using the method of 80% ethanol to extract total flavonoids . Then to determine the extractive of petroleum ether, ethyl acetate of total flavonoids of the fermented tabanid different polar parts table by using NaNO2-AlCl3-NaOH colorimetric method. The results showed that the average content of total water-soluble protein after fermentation as high as 99.3140 mg/g , while the total flavonoids content in the ethanol extract was significantly higher than that in the petroleum ether and ethyl acetat.

fermentation; tabanid; ultrasonic extraction; ethanol extraction; content comparison

2017-02-15

山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練(SRT)計(jì)劃資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2016052)

王立娜(1996—)，女，本科在讀，研究方向制藥工程；通訊作者：王集會(huì)(1962—)，副教授，研究方向：蟲類中藥發(fā)酵及活性成分研究。

R284

A

1008-021X(2017)06-0082-02