王彥多，劉春雨,呂世潔，王集會，陳 智*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝研究

王彥多1，劉春雨1,呂世潔1，王集會2，陳 智2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

目的:探究發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮的最佳提取工藝。方法:通過紫外可見分光光度法測定發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮含量，以總黃酮浸出量為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法，優(yōu)化發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果:回流提取法提取總黃酮的最佳提取工藝為：提取溫度70 ℃，提取時(shí)間1.5 h，料液比1:25。

正交實(shí)驗(yàn);總黃酮;提取工藝

蜈蚣為蜈蚣科動(dòng)物少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)。辛，溫；有毒[1]。蜈蚣是傳統(tǒng)中藥材，具有通絡(luò)止痛，解毒散結(jié)，息風(fēng)止痙的作用[2]。臨床常用其治療腫瘤、原發(fā)性高血壓、神經(jīng)性頭痛、糖尿病及并發(fā)癥、偏頭痛等[3-4]。

黃酮類化合物具有抗氧化壓力、抗炎和抑制癌基因表達(dá)的作用[5],因此黃酮類化合物成為人們研究的熱點(diǎn)。通過使用球孢白僵(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)對蜈蚣進(jìn)行發(fā)酵可以提高蜈蚣中黃酮類物質(zhì)的含量，增強(qiáng)其解毒散結(jié)的功效，還可以較大幅度的改變藥性、降低毒副作用和提高療效[6]。

本實(shí)驗(yàn)采用紫外可見分光光度法對發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮類化合物含量進(jìn)行最佳提取工藝優(yōu)化研究。通過參考文獻(xiàn)資料確定以提取溫度、提取時(shí)間、料液比作為考察因素,通過設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)來探究三種因素對發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮提取量的影響,從而確定最佳提取工藝條件。本實(shí)驗(yàn)采用發(fā)酵蜈蚣粉,具有創(chuàng)新性，有關(guān)發(fā)酵蜈蚣的文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)未見報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器設(shè)備

UV9100B型紫外可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)； ST 16R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；FA1004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；SK-1快速混勻漩渦器(中國 深圳)；遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱(上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；梅特勒-托利多分析天平(上海先悅機(jī)電有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

蘆丁對照品(中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn))，亞硝酸鈉，無水乙醇，六水氯化鋁，氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.3 供試品

本實(shí)驗(yàn)所使用的蜈蚣粉購自安徽亳州市(批號：20150730)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高德民教授鑒定為少棘巨蜈蚣粉(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)。發(fā)酵蜈蚣粉(批號：20160301)由山東中醫(yī)藥大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁對照品0.02000 g，用60 % 的乙醇溶解并定容至 100 mL。分別取此溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL ，加入30 % 的乙醇至5 mL，再加入5 % 的NaNO2溶液0.30 mL ，搖勻后靜置6 min ，加入10 % 的AlCl3·6H2O溶液0.60 mL ，搖勻后靜置 5 min ，然后加入4 % 的NaOH溶液2.00 mL，加入30 % 的乙醇定容至10 mL 刻度，搖勻，于510 nm 處測定吸光度，以吸光度對濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁對照品溶液在此濃度范圍內(nèi)與吸光度成良好線性關(guān)系，線性回歸方程為A=0.9543C，A為吸光度，C為總黃酮含量，線性相關(guān)系數(shù)為r=0.9996[7-8]。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取發(fā)酵蜈蚣粉1.0000 g ，按料液比加入80 % 乙醇，回流提取兩次,進(jìn)行抽濾，取上清液于3000 r/min 離心10 min ，收集上清液于50 mL容量瓶中定容。置于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆肹9]。

2.3 顯色方法及波長測定

采用NaNO2-AlCl3-NaOH顯色法、紫外可見分光光度法測定發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮含量,待測樣品于510 nm 處有最大吸收。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)為三個(gè)因素，根據(jù)文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)資料選取三個(gè)較優(yōu)水平:提取溫度60,70,80 ℃ ;提取時(shí)間1,1.5,2 h ;料液比1:15,1:20,1:25 g/mL，做正交試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)平行3次，取平均值。正交實(shí)驗(yàn)因素見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素

3 結(jié)果與討論

3.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)考察了3個(gè)影響因素和3個(gè)水平,故選用4因素3水平9次實(shí)驗(yàn)的正交實(shí)驗(yàn)表,記為L9(34)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)表

表3 方差分析表

注:F0 .01(2,2)=99%

由方差分析得出: 提取溫度 (A)、料液比 (B)、提取時(shí)間(C)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果都具有顯著性影響。各因素對發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮提取的顯著性影響次序?yàn)? 提取溫度 (A) >料液比 (B) >提取時(shí)間 (C)。由此，得到正交實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最佳提取條件A2B3C2，即提取溫度為70 ℃ ，料液比為1:25，提取時(shí)間為1.5 h。

3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

于最佳提取條件A2B3C2下重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果見表4。

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

由表4可知：按最佳提取條件從1.0000 g發(fā)酵蜈蚣粉中提取總黃酮的平均提取量為20.311 mg/g,提取量高且具有重復(fù)性, 驗(yàn)證了所選提取工藝參數(shù)的合理性。

4 討論

由方差分析得出:提取溫度對發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮的提取影響最大,其中當(dāng)提取時(shí)間為70℃時(shí)提取量最高。料液比對發(fā)酵蜈蚣粉的提取影響次于提取溫度的影響,且隨著料液比增大,提取效果提高。提取時(shí)間對于發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮提取量的影響也較大,但次于提取溫度和料液比的影響,其中1.5 h提取效果最好。實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮提取的最佳提取工藝條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提取溫度是影響黃酮提取的關(guān)鍵性因素。通過最佳提取工藝得到發(fā)酵蜈蚣粉中的總黃酮含量為20.311 mg/g。

研究表明，黃酮類化合物具有抗炎、抑制癌細(xì)胞基因表達(dá)的作用[5]。近年來，隨著抗腫瘤藥理作用研究的不斷深入，其在臨床抗腫瘤的應(yīng)用上也更加廣泛。通過發(fā)酵可以提高脂溶性黃酮的含量，因此，對發(fā)酵后蜈蚣提取黃酮的藥理學(xué)研究還有待進(jìn)行。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部(2010年)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版,2010:335-336.

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[3] 張 艷,劉西建.抗腫瘤的有毒中藥現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)在遠(yuǎn)程教育,2012(24):154-158.

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(本文文獻(xiàn)格式：王彥多，劉春雨,呂世潔，等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝研究[J].山東化工，2017，46(06)：16-17.)

Study on Ultrasonic Extraction of Total Flavone from Ferment Centipede Powder with Orthogonal Experiment

WangYanduo1,LiuChunyu1,LyuShijie1,WangJihui2，ChenZhi2*

(1. College of pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

Objective:To explore the best extraction process of total flavone from ferment centipede powder.Method：UV-vis was used to determine the content of total flavone and using orthogonal experiment to optimize it. Result:The best extracting process to extract total flavone with reflux extraction is under the power of ultrasound wave of 1:25 g/mL, 70 ℃ of the extraction temperation and 1.5 h of the extraction time.Under these conditions,the content of flavone in extraction is 20.311 mg/g.

orthogonal test；total flavone；extraction process

2017-02-13

山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練(SRT)計(jì)劃資助項(xiàng)目，校編號：2016054

王彥多(1997—)，女，山東濟(jì)南人，2015級中藥學(xué)專業(yè)本科生；通信作者：陳 智，講師，研究方向：中藥新藥與中藥炮制原理研究。

R283

A

1008-021X(2017)06-0016-02