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        高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定糞箕篤中小檗堿和千金藤素含量

        2017-09-04 12:42:08白麗麗戴華程莎孔杜林
        關(guān)鍵詞:串聯(lián)質(zhì)譜法高效液相色譜含量測(cè)定

        白麗麗++++++戴華++++++程莎++++++孔杜林

        [摘要] 目的 建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定海南糞箕篤中小檗堿和千金藤素含量的方法。 方法 色譜柱Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A(2.0 mm×50 mm,4 μm);流動(dòng)相為水(0.1‰甲酸,A相)-甲醇(0.1‰甲酸,B相);柱溫40℃,流速為0.35 mL/min,梯度洗脫。采用電噴霧正離子模式電離,選擇多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 小檗堿和千金藤素在5.0~1000.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)> 0.98;小檗堿的平均回收率為101.46%~104.76%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.14%;千金藤素的平均回收率為95.96%~104.39%,RSD為4.63%;測(cè)得文昌、興隆兩地糞箕篤中小檗堿和千金藤素分別為0.889、1.07 μg/g和7.62、38.0 μg/g。 結(jié)論 HPLC-MS/MS具有簡(jiǎn)單、分析速率快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),適用于糞箕篤及千金藤屬植物中生物堿的定量分析。

        [關(guān)鍵詞] 糞箕篤;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;生物堿;含量測(cè)定

        [中圖分類(lèi)號(hào)] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2017)07(c)-0145-03

        [Abstract] Objective To establish a method for the simultaneous determination of berberin and cepharanthine in Stephania longa L. by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Methods The separation of the analytes were carried out on a Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A column (2.0 mm×50 mm, 4 μm) using methanol containing 0.1‰ formic acid as mobile phase, the column temperature was 40℃, flow rate was 0.35 mL/min, gradient elution. HPLC-MS/MS was performed in multiple reaction monitoring mode via positive electrospray ionization (ESI+). Results The calibration curves showed good linearity over the tested range from 5.0 to 1000.0 ng/mL for 2 compounds (the correlation coefficients> 0.98).The recoveries and the relative standard deviations of berberin and cepharanthine was 101.46%-104.76%, 2.14% and 95.96%-104.39%, 4.63% respectively. The content of berberin and cepharanthine in Stephania longa L. from Wenchang, Xinglong 2 areas were 0.889, 1.07 μg/g and 7.62, 38.0 μg/g. Conclusion The method is simple, fast and highly sensitivity, which can be used to control the quality of alkaloids from Stephania longa L..

        [Key words] Stephania longa L.; HPLC-MS/MS; Alkaloids; Content determination

        糞箕篤(Stephania longa L.)為防己科千金藤屬植物,多年生草質(zhì)藤本。在我國(guó)福建、廣東、海南等地區(qū)有廣泛分布,是天然的南藥資源[1]。具有清熱解毒、消腫利濕、袪風(fēng)活絡(luò)、抑菌、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等功效[2-7]。該屬藥用植物繁多,富含生物堿,主要有可撲堿型、阿撲堿類(lèi),原小檗堿類(lèi),蓮花烷類(lèi)生物堿、雙芐基異喹啉類(lèi)、嗎啡二烯酮型等。有關(guān)糞箕篤中生物堿的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及化學(xué)合成均有報(bào)道[8-12],生物堿含量測(cè)定的方法很多[13-18],但采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)對(duì)糞箕篤生物堿進(jìn)行定性定量分析尚未有報(bào)道。為尋找千金藤屬植物中有用的生物堿資源,本文通過(guò)對(duì)海南文昌、興隆糞箕篤根莖中的兩種生物堿進(jìn)行含量測(cè)定,建立HPLC-MS/MS定性定量分析方法,為糞箕篤及其千金藤屬植物的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論指導(dǎo)。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        儀器:API4000+串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀(AB Sciex公司,美國(guó)),通過(guò)Turbo V離子源接口與島津公司Prominence UFLC液相色譜儀串聯(lián)。AB-SCIEX軟件控制數(shù)據(jù)采集和處理;液質(zhì)聯(lián)用儀LC-MS專(zhuān)用氮?dú)獍l(fā)生器(NitroFlowLab,美國(guó));離心機(jī)(Sigma,德國(guó));分析天平(北京賽多利斯公司);超純水器(Millipore公司);紫外分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器有限公司)。

        1.2 試藥

        小檗堿(批號(hào)110713-201613)和千金藤素(批號(hào)111647-200301)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究所);甲醇(HPLC級(jí),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),乙腈為優(yōu)級(jí)純(Tedia,美國(guó));其他藥品均為分析純,水為超純水。

        糞箕篤采自海南文昌、興隆,由海南醫(yī)學(xué)院曾念開(kāi)教授鑒定為防己科(Menispermaceae)千金藤屬(Stephania)糞箕篤,陰干,粉碎成細(xì)粉備用。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 對(duì)照品溶液的制備

        精密稱(chēng)取適量小檗堿和千金藤素于容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋定容至刻度配制成1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4℃冰箱中儲(chǔ)存。

        2.2 供試品溶液及樣品的制備

        精密稱(chēng)定恒溫干燥的糞箕篤粉末2 g(精確至0.0001 g),置于圓底燒瓶中,用85%乙醇回流2 h,過(guò)濾,于200 mL容量瓶中定容至刻度,于4℃冰箱中儲(chǔ)存、備用。

        將供試品溶液轉(zhuǎn)移至離心管中,5000 r/min離心5 min,吸取5.0 mL上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,制成樣品等待分析。

        2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

        色譜條件:色譜柱為Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A(2.00 mm×50 mm,4 μm);流動(dòng)相為水(0.1‰甲酸,A相)-甲醇(0.1‰甲酸,B相);柱溫40℃,流速為0.35 mL/min,進(jìn)樣體積5.0 μL梯度洗脫:0~1 min為0% B,1~1.01 min B相從0%迅速增加到30%,1.01~10 min B相從30%緩緩增加到100%,10~10.01 min從100%回到0%,10.01~15 min維持在0% B進(jìn)行平衡。

        質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)正離子模式(+),噴霧電壓5.5 kV,噴霧溫度550℃,簾氣為25psi,GAS1為40psi、GAS2為60psi,CAD為6;多反應(yīng)檢測(cè)掃描(MRM)模式對(duì)小檗堿、千金藤素進(jìn)行掃描,每個(gè)離子對(duì)的掃描時(shí)間為10 ms。小檗堿和千金藤素檢測(cè)離子對(duì)分別為337.10→321.10和607.3→365.1。兩種生物堿的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

        2.4 線性關(guān)系考察

        準(zhǔn)確移取小檗堿(1.0 μg/mL)、千金藤素(1.0 μg/mL)的對(duì)照品溶液并依次配成5.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1000.0 ng/mL對(duì)照品溶液,分別注入液-質(zhì)色譜儀,記錄峰面積。分別以質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,小檗堿回歸方程為:Y=6.91×103X+1.27×104(r=0.9993),千金藤素回歸方程為:Y=5.96×102X+3.6×103(r=0.9898)。結(jié)果表明小檗堿和千金藤素均在5.0~1000.0 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

        2.5 方法學(xué)考察

        2.5.1 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取興隆采摘的糞箕篤粉末2.0 g,按“2.2”項(xiàng)下方法提取,制成樣品溶液。按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件,進(jìn)樣5 μL,測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)得峰面積。小檗堿的RSD為1.90%,千金藤的RSD為2.61%。表明重復(fù)性良好。

        2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 把制好的樣品溶液及100.0 ng/mL的對(duì)照品溶液置于4℃冰箱中儲(chǔ)存,分別于0、4、8、12、16、24 h后,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣5 μL,測(cè)定。對(duì)照品小檗堿、千金藤素的RSD分別為2.25%、2.32%,樣品溶液小檗堿、千金藤素的RSD分別為2.12%、1.89%。結(jié)果表明,與0 h相比較,24 h后峰面積基本保持不變。結(jié)果表明對(duì)照品及供試品溶液穩(wěn)定性良好。

        2.5.3 精密度和回收率 采用空白樣品加標(biāo)的方法進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn),在空白樣品中添加低、中、高3個(gè)水平的標(biāo)樣后(10.0、100.0、500.0 ng/mL),每個(gè)添加量平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明小檗堿的平均回收率為101.46%~104.76%,RSD為2.14%;千金藤素的平均回收率95.96%~104.39%,RSD為4.63%,結(jié)果表明該方法回收率穩(wěn)定,可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。小檗堿和千金藤素對(duì)照品質(zhì)譜圖如圖1所示:其中縱坐標(biāo)表示響應(yīng)強(qiáng)度(cps),橫坐標(biāo)表示保留時(shí)間(min)。從圖1可知,小檗堿對(duì)照品和千金藤素對(duì)照品分別在3.22、3.01 min處出峰。

        2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

        文昌和興隆兩地采摘的糞箕篤根莖經(jīng)陰干、粉碎成40目細(xì)粉。分別精確稱(chēng)取2.0 g粉末經(jīng)回流、過(guò)濾后按“2.2”項(xiàng)下方法處理成樣品,定容至100 mL,經(jīng)紫外分光光度法測(cè)得其總生物堿含量平均為0.40%[10]。樣品經(jīng)質(zhì)譜分析如圖1所示:文昌和興隆糞箕篤中小檗堿、千金藤素分別在3.21、3.19;2.98、2.99 min處出峰,峰形尖銳。測(cè)得文昌、興隆兩地小檗堿含量分別為0.889、1.07 μg/g,千金藤素含量分別為7.62、38.0 μg/g,分別占總堿含量的0.022%、0.027%和0.19%、0.95%。

        3 討論

        由于提取方式的不同,所得總生物堿也有所不同;同一藥材不同產(chǎn)地的各種生物堿的種類(lèi)及含量亦有一定的差異[19-20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,海南兩地糞箕篤中小檗堿和千金藤素含量有明顯差異,千金藤素含量遠(yuǎn)高于小檗堿,但小檗堿地區(qū)間含量差異不是十分明顯。本方法采用梯度洗脫,分別考察了水-甲醇、水-乙腈、水-甲醇(1‰甲酸)及水-乙腈(1‰甲酸)作為流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)在不含酸的體系中小檗堿、千金藤素有拖尾現(xiàn)象;而水-乙腈(1‰甲酸)作為流動(dòng)相,基線不是很穩(wěn)定,分離效果不如水-甲醇(1‰甲酸)效果好。因此,本研究采用水-甲醇(1‰甲酸)為流動(dòng)相。使用的UFLC液相色譜儀配Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A型色譜柱,與文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道HPLC比較,具有用時(shí)少、出峰快速、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)。本研究?jī)H對(duì)海南當(dāng)?shù)厮幉倪M(jìn)行上述相關(guān)考察,其他不同地區(qū)及植物不同部位的質(zhì)量考察還有待進(jìn)一步研究。

        總之,本試驗(yàn)建立的HPLC-MS/MS方法具有分析速率快、靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可用于糞箕篤及千金藤屬植物中生物堿的定量分析。

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