陳紫岳 黃怡然 李 娜 夏 晶 馬 瑩 張冰月 梁亞峰 李文迅

(1 北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,北京,100020; 2 北京中醫(yī)藥大學附屬護國寺中醫(yī)醫(yī)院,北京,100032)

電針和圓利針治療制動致膝關節(jié)功能障礙兔模型的治療效果

陳紫岳1黃怡然1李 娜2夏 晶1馬 瑩1張冰月1梁亞峰1李文迅1

(1 北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,北京,100020; 2 北京中醫(yī)藥大學附屬護國寺中醫(yī)醫(yī)院,北京,100032)

目的:比較電針和圓利針治療制動致膝關節(jié)功能障礙模型兔的療效及機制。方法:將新西蘭兔24只隨機分為4組:正常組、模型組、圓利針組和電針組，每組6只,除正常組外均建立制動致膝關節(jié)功能障礙模型。造模6周后干預組接受干預。于造模后4，8，12周測量兔患側Lequesne MG總指數(shù);于造模后13周通過光學顯微鏡觀察股直肌超微結構;于造模第12周通過X線對膝關節(jié)進行整體評價。結果:行為學:電針與圓利針對于關節(jié)功能障礙、局部反應、腫脹有明顯的療效(P<0.05)且2種方法差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);光鏡:電針組(P<0.05)與圓利針組(P<0.01)治療起效明顯但圓利針組療效更佳;X線:干預組結果明顯優(yōu)于模型組且圓利針組較佳。結論:針和圓利針對于固定制動引起的關節(jié)功能障礙均有確切療效,但圓利針通過對受損軟組織的直接干預,能更有效地治療制動引起的關節(jié)功能障礙。

電針;圓利針;行為學;超微結構;X線

固定制動作為一種常用的治療或輔助治療手段,具有緩解疼痛、加速傷口愈合,盡早恢復健康等作用,廣泛應用于各種骨與軟組織疾病和創(chuàng)傷中[1-2],但由于組織的功能適應的特性,也是引起關節(jié)運動障礙的常見原因。制動將關節(jié)長期固定于某一位置,限制了關節(jié)的運動,可引起組織廢用性改變,會對所涉及的軟骨、周圍軟組織造成新的損傷,導致關節(jié)攣縮和功能障礙,因此，制動期間的康復處理和制動后的肢體功能康復越來越被重視。針灸治療關節(jié)及軟組織相關疾病療效顯著[3]。以松解作用為主的圓利針和取穴治療的電針在治療相關疾病上不僅綜合了針灸的特點,并且具有各自獨特的優(yōu)勢療,研究電針與圓利針對于制動后的肢體功能障礙的治療效果,具有重要的現(xiàn)實意義。本研究旨在驗證并比較電針與圓利針對于固定制動膝關節(jié)運動障礙模型兔的治療效果,為臨床治療制動引起的關節(jié)活動障礙后遺癥提供科學依據(jù)和有效的康復治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 新西蘭雄兔24只,6個月齡,體重2.0～2.5 kg。生產(chǎn)許可證編號:SYXK(京)2013-0022,提供公司為北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司。實驗過程嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.1.2 試劑與儀器 1)石膏繃帶購自北京百諾威生物科技有限公司;2)圓利針針:樂灸牌一次性圓利針端為針尖無刀刃(馬鞍山邦德醫(yī)療器械有限公司),規(guī)格:0.4 mm×40 mm;一次性無菌針灸針(環(huán)球牌,蘇州針灸用品有限公司),規(guī)格:0.25 mm×25 mm;3)電針儀:HANS穴位神經(jīng)刺激儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司),型號:LH202H型;4)萬東鼎立HM-32型移動式高頻醫(yī)用診斷用射線機,北京萬東鼎立醫(yī)療設備有限公司,北京寵寶康動物醫(yī)院有償服務;5)7.0T超高場磁共振成像掃描儀及輔助設備,德國Bruker公司,北京天壇醫(yī)院有償服務;6)康復功能評定關節(jié)測量儀FJDC,上海欣曼科教設備有限公司;7)石蠟切片機:Leitz 1410型，德國;8)BMJ-III型包埋機及冷凍臺，中國;9)H8-202型尼康顯微鏡:(日本Nikon);10)奧林巴斯全自動顯微攝影系統(tǒng):日本制造;11)超薄切片機:瑞典LKB;12)光學顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 改良后的Videman經(jīng)典關節(jié)制動造模法:于造模前新西蘭兔禁食10～16 h(除正常組外),麻醉,剪毛,固定(膝伸直180°,踝背屈60°),膝關節(jié)制動6周,留出足趾以便于觀察血供。隨機分為正常、模型、電針和圓利針4組,每組6只。

1.2.2 干預方法 正常組:正常喂養(yǎng)。模型組:造模并正常喂養(yǎng)。電針組:造模6周后,毫針針刺(蘇州針灸用品有限公司)模型兔左側:電極順序為陽陵泉接正極、陰陵泉接負極,內(nèi)膝接眼正極、外膝接眼負極。電針(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司)強度3 mA,疏密波,電針頻率為2/100 Hz。隔日1次，3次每周,1次20 min,總共6周。圓利針組:造模6周后,一次性圓利針(馬鞍山邦德醫(yī)療器械有限公司)提插松解5次,每周1次,共6周。進針點如下:內(nèi)、外側副韌帶中點前緣進針;髕韌帶縱軸線處。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 行為學 分別于造模后4,8,12周的時間窗,根據(jù)Lequesne MG評估方法[4]評價。

1.2.3.2 形態(tài)學 所有干預結束1周,處死動物后迅速取模型兔髕骨上方股直肌取5 mm×5 mm×8 mm一方塊標本進行組織固定,光鏡觀察并進行評分:0分:無明顯病理組織學改變;1分:肌細胞輕度腫脹、出血,僅見少量散在炎性細胞浸潤;2分:肌細胞中度水腫,少許肌細胞變性壞死、斷裂,有明顯炎性細胞浸潤,散在毛細血管增生;3分:肌細胞明顯腫脹,大量肌細胞透明樣變性、斷裂、壞死,大量炎性細胞浸潤。

1.2.3.3 影像學 于造模后12周時拍攝所有組別膝關節(jié)X射線膝關節(jié)正、側位片。X線攝片條件:膠-片距50 cm，管電流8.0 mA，60 mA,管電壓42 kV。

1.3 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,后以Levene檢驗方差齊性,若方差齊使用LSD方法進行多重比較,若方差不齊則使用采用近似F檢驗代替方差分析后采用Dunnett′s T3方法進行多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 行為學 3組造模兔Lequesne MG總指數(shù)在造模4周起至造模后12周總指數(shù)呈總體下降趨勢。造模后第4周,3組造模兔Lequesne MG總指數(shù)明顯升高,與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),但模型組、電針組和圓利針組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。第12周電針組與圓利針組總指數(shù)大幅下降,與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),與該2組第4周(P<0.01)和第8周(P<0.05)時間窗階段的Lequesne MG總指數(shù)比較均有統(tǒng)計學意義。兩干預組間各個時間窗階段差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組實驗性膝關節(jié)功能障礙模型兔不同時間窗Lequesne MG總指數(shù)

注：與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較，△△P<0.01。與造模日比較，▲▲P<0.01;與造模后4周比較,□□P<0.01;與造模后8周比較,■P<0.05

2.2 形態(tài)學

2.2.1 光鏡下各組兔損傷局部肌細胞形態(tài)圖 圖1A為正常組兔股直肌肌細胞橫切面(100倍),肌細胞大小均等,呈多邊形,肌漿紅色,核位于邊緣呈圓或橢圓形;圖1B分別為正常組兔股直肌肌細胞縱切面(100倍),肌細胞呈長條形,平行排列,多個扁橢圓形核位于肌細胞周邊。圖2A為兔股直肌肌細胞橫切面(100倍),部分肌細胞邊界模糊,水腫,肌漿外漏,大小不一,部分肌細胞變性壞死,肌細胞間及結締組織處大量紅細胞及炎性細胞浸潤;圖2B為正常組兔股直肌肌細胞縱切面(100倍),肌細胞排列無序混亂,部分肌細胞水腫,結締組織增生,部分肌細胞萎縮、溶解、斷裂。細胞核增多,大量炎性細胞及少量紅細胞浸潤。圖3為兔股直肌肌細胞橫切面(100倍),肌細胞水腫、橫切面為多邊形,形狀不規(guī)則,大小較為一致,肌細胞間隙縮小,部分肌細胞溶解、變性、壞死,壞死肌細胞處及周圍血管處有炎性細胞浸潤;圖3B(100倍)為正常組新西蘭兔股直肌肌細胞縱切面放大40倍、100倍和400倍,鏡下示:肌細胞排列較模型組整齊,Z線、M線較為清晰,肌細胞腫脹,肌細胞間炎性細胞浸潤。圖5為圓利針組股直肌肌細胞橫切面(100倍),肌細胞橫切面為形狀不規(guī)則的多邊形,大小較一致,肌細胞輕度水腫,間隙稍縮小,部分肌細胞溶解、變性、壞死,肌間少量炎性細胞及紅細胞浸潤;圖4(100倍)為正常組新西蘭兔股直肌肌細胞縱切面放大100倍,鏡下示:肌細胞排列較模型組整齊,Z線、M線模糊,部分肌細胞腫脹,部分肌細胞溶解、萎縮、斷裂,肌細胞間周圍血管處炎性細胞浸潤。

圖1 正常組兔左側膝關節(jié)股直肌染色(HE染色×100)

2.2.2 光鏡下各組實驗性兔股直肌組織損傷程度評分結果 與正常組比較,其余組HE染色光鏡下股直肌組織損傷評分均有不同程度的增高,模型組(P<0.01)和電針組(P<0.05)增高差異有統(tǒng)計學意義,圓利針組增高差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組比較,電針組(P<0.05)與圓利針組(P<0.01)組織損傷評分結果均有下降且有明顯差異。兩干預組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

圖2 模型組兔左側膝關節(jié)股直肌染色(HE染色×100)

圖3 組兔左側膝關節(jié)股直肌染色(HE染色×100)

圖4 圓利針組兔左側膝關節(jié)股直肌染色(HE染色×100)

組別例數(shù)評分正常組60.00±0.00模型組62.20±0.84**電針組61.20±0.84*△圓利針組60.80±0.84△△

注：與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05，△△P<0.01

圖5 正常組正位片 圖6 正常組側位片

2.3 影像學 造模后12周各組兔X線片結果顯示:正常組兔膝關節(jié)關節(jié)面光滑、間隙正常(圖5，6);模型組關節(jié)間隙明顯狹窄,脛骨平臺軟骨下方骨密度增高明顯,并且發(fā)現(xiàn)大量骨贅形成,伴隨關節(jié)扭轉(zhuǎn)與畸形(圖7，8);電針組可見關節(jié)間隙稍有狹窄,內(nèi)側軟骨下骨密度增高,關節(jié)面骨贅形成,與此同時出現(xiàn)關節(jié)扭轉(zhuǎn)(圖9，10);圓利針組脛骨平臺軟骨下方骨密度稍有增高,關節(jié)面有少許骨贅形成,關節(jié)間隙狹窄,干預治療2組比較。圓利針影像學結果略優(yōu)于電針組(圖11，12)。

圖7 模型組正位片 圖8 模型組側位片

圖9 電針組正位片 圖10 模型側位片

3 討論

動物實驗及研究過程中,復制實驗動物的模型是實驗研究中的關鍵點,模型的可靠、可行和適用性直接密切關系到實驗結果的科學性。行為學結果Lequesne MG總指數(shù)表明膝關節(jié)功能障礙模型已造模成功。骨骼肌受損后,炎性細胞浸潤,進而吞噬壞死肌纖維碎片、分泌多種生長因子,參與骨骼肌的修復[5],但是炎性反應過度時,高濃度的細胞溶解物和細胞毒素可進一步加重肌肉損傷[6]。通過本實驗中光學顯微鏡結果我們發(fā)現(xiàn),制動在導致關節(jié)功能障礙的同時,也影響相關骨骼肌形態(tài)結構。目前認為,骨骼肌的收縮機制主要為英國科學家Huxley提出的肌絲滑動原理,結構正常、完整的Z線、M線及A帶、I帶對是骨骼肌的正常收縮的必要保證。固定制動模型對骨骼肌的基本結構造成損害、參與骨骼肌正常收縮的相關環(huán)節(jié)缺失,可導致步態(tài)改變、關節(jié)活動度減小等一系列功能障礙[7-8],這與行為學研究結果一致。目前關于膝關節(jié)功能障礙相關疾病的影像學研究中,以臨床實驗居多,大量臨床研究結果表明功能障礙相關疾病在影像學上均有明顯體現(xiàn)。如王守玉等[9]、Minafra等[10]陳小軍[11]通過對膝關節(jié)功能障礙模型發(fā)病期的膝關節(jié)的影像研究發(fā)現(xiàn)病變膝關節(jié)有關節(jié)面增生和關節(jié)間隙狹窄等病理表現(xiàn)。本實驗X線結與上述膝骨關節(jié)炎臨床研究的X線研究結果基本一致。上述結果表明膝關節(jié)制動的同時,不僅對周圍軟組織產(chǎn)生了影響,更進一步對骨、關節(jié)等造成了損傷。制動模型在影像學上與膝骨關節(jié)炎的臨床影像檢驗結果有類似病理表現(xiàn)。因此,可得出本實驗復制的膝關節(jié)制動功能障礙模型基本符合關節(jié)功能障礙疾病的特點,將本模型應用于膝關節(jié)功能能障礙疾病的實驗研究具有靠性、適用性和可行性。

圖11 圓利針組正位片 圖12 模型組側位片

針灸治療關節(jié)及軟組織相關疾病療效顯著[12-14],以松解作用為主的圓利針和取穴治療的電針在治療上不僅綜合了針灸的特點,并且具有各自獨特的優(yōu)勢,因此將這2種針法療效進行比較,具有重要的現(xiàn)實意義。綜合本實驗制動模型兔膝關節(jié)行為學、形態(tài)學和影像學研究結果,干預組的指標均有明顯改善,表明2種干預方法對于固定制動引起的功能障礙療效確切,但圓利針組略優(yōu)于電針組比較于圓利針松解術,電針可以其良好的止痛作用[15-18],更有效地改善關節(jié)活動范圍,從而改善步態(tài)。DYN，ENK與β-EP是鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的主要內(nèi)源性神經(jīng)化學物質(zhì)[19]。韓濟生實驗室發(fā)現(xiàn),可通過2 Hz電刺激后,人和大鼠腦脊液中的β-E和PENK的含量增加,而通過100 Hz電刺激后,DYN含量升高[20-21],低頻(2 Hz)與高頻(100 Hz)電針均有良好的鎮(zhèn)痛作用。另一項隨機對照研究發(fā)現(xiàn)[22],低頻電針與高頻電針均有良好的鎮(zhèn)痛作用且2/100 Hz針效顯著高于2 Hz和100 Hz電針鎮(zhèn)痛功效[23-24]。而關節(jié)疼痛的緩解與關節(jié)活動度的恢復密切相關[25],電針通過緩解疼痛增加了膝關節(jié)活動度范圍從而改善了步態(tài)。因此,第12周時間窗階段電針組與圓利針組Lequesne MG總指數(shù)無明顯差異。光鏡下結果表明比較于電針取穴療法,圓利針這類以松解作用為主的針法治療膝關節(jié)功能障礙相關的軟組織損傷在肌肉微觀結構上修復作用更佳[26-27],從影像學結果與形態(tài)學指標結果一致?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),制動可對周圍軟組織[28]產(chǎn)生不同程度的影響,從而進一步損傷骨、關節(jié),因此,周圍軟組織損傷是導致關節(jié)功能障礙、腫脹、局部反應的重要原因。盧鼎厚等[29-30]研究發(fā)現(xiàn),肌肉損傷后,斜刺阿是穴可加強肌纖維的收縮蛋白組裝及合成,促進肌纖維收縮的結構及其功能的恢復,且其效果是通過固有的肌肉本身的外周機制實現(xiàn)的[31],而非神經(jīng)或經(jīng)絡機制。因此,造模后12周行為學、形態(tài)學、影像學3項試驗指標可能說明,相較于電針的取穴治療,圓利針松解術對外周受損軟組織的直接干預能更好的促進其修復。

綜上所述,將兔膝關節(jié)制動模型應用于膝關節(jié)功能能障礙疾病的實驗研究具有可靠性、適用性和可行性。電針和圓利針對于固定制動引起的關節(jié)功能障礙均有確切療效,但能更有效地治療制動引起的關節(jié)功能障礙。本研究也存在以下不足,由于研究項目時間的限制,本研究未進行電針與圓利針遠期療效的比較,未研究電針與圓利針的治療機制及近期療效差異的原因。因此,進一步研究可對針刀電針的遠期療效進行比較并研究兩者的治療機制。

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(2017-01-07收稿 責任編輯：楊覺雄)

Comparison Research of EA and RSA Treating Knee Joint Dysfunction Caused by Knees Immobilization in Rabbit Models

Chen Ziyue1,Huang Yiran1,Li Na2,Xia Jing1,Ma Ying1,Zhang Bingyue1,Liang Yafeng1，Li Wenxun1

(1SchoolofAcupunctureandMoxibustion,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100020,China; 2HuguosiTraditionalChineseMedicineHospital,Beijing100020,China)

Objective:To compare curative effect and mechanism of EA therapy and RSA therapy in treating knee joint dysfunction caused by knees immobilization.Methods:Randomly divided 24 New Zealand rabbits into four groups: normal group,model group,RSA group and EA group,with 6 rabbits of each group.Make knee joint dysfunction model except for normal group.Treatment groups

treatment after 6 weeks of modeling.The Lequesne MG was evaluated at 4,8,12 weeks after modeling.HE staining was observed at 13 weeks after modeling.X-ray were used to assess the radiological changes of knee joint dysfunction model rabbits.Results:Behavioral: EA and RSA therapy can effectively relieve movement disorder (P<0.05),swelling local reaction in knee joint dysfunction model rabbits and the effects were similar within two groups (P>0.05.Light microscope: EA(P<0.05) and RAS(P<0.01) therapies could all worked effectively but RSA group behaves better than EA group.X-ray: Tow therapies could all worked effectively but RSA group is superior to EA group.Conclusion:EA and RSA therapy showed definite effect on knee joint dysfunction model rabbits caused by knees immobilization,and RSA therapy is better for its direct intervention on soft tissue.

EA;RSA; Behaviour; Ultrastructural; X-ray

北京中醫(yī)藥大學科研基金資助項目(2012-QNJSZX010) 作者簡介:陳紫岳(1991.05—),女,研究生,研究方向:運動神經(jīng)系統(tǒng)疾病的針灸康復治療,E-mail:13051169092@163.com

李文迅(1965.02—),男,研究生,副教授、副主任醫(yī)師,北京中醫(yī)藥大學實訓中心主任,研究方向:運動神經(jīng)系統(tǒng)疾病的針灸康復治療,E-mail:agoodfriend@126.com

R245；R247.9

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.08.051