王筱夢(mèng)，孫芝蘭*，諸永志，卞 歡，吳海虹，劉 芳，江 蕓，王道營(yíng)，徐為民3

羊肉屠宰加工場(chǎng)主要污染菌的分布及其對(duì)熟制羊肉的致腐能力

王筱夢(mèng)1,2，孫芝蘭1,*，諸永志1，卞 歡1，吳海虹1，劉 芳1，江 蕓2，王道營(yíng)1，徐為民1,3

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院食品科學(xué)系，江蘇 南京 210097；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

對(duì)江蘇省蘇州市具有代表性的某羊屠宰場(chǎng)的屠宰環(huán)境及熟制品加工車間進(jìn)行微生物檢測(cè)，重點(diǎn)對(duì)熟制品加工過程進(jìn)行檢測(cè)，包括煮制車間的接觸面、各加工車間的空氣以及清洗前后的生肉與煮制后的熟肉，以確定熟制品加工過程中污染菌群的分布。結(jié)果表明，熟制品加工過程中各加工車間空氣細(xì)菌數(shù)均低于10 CFU/皿，表明空氣質(zhì)量合格。而煮制車間的接觸面污染較嚴(yán)重致使交叉污染造成熟制羊肉的菌落總數(shù)達(dá)到3.23（lg（CFU/cm2））。結(jié)合形態(tài)觀察和16S rDNA菌種鑒定，所污染的菌主要為芽孢桿菌、腐生葡萄球菌、變形桿菌、金黃桿菌和微桿菌等。隨后選取3 個(gè)污染菌芽孢桿菌（Bacillus sp. M1、Bacillus sp. M9）和腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus M7），通過對(duì)熟制羊肉的感官評(píng)分、pH值、菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮值和腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子的測(cè)定評(píng)定它們對(duì)熟制羊肉的致腐能力。結(jié)果顯示，Bacillus sp. M1的致腐能力最強(qiáng)且明顯高于S. saprophyticus M7和Bacillus sp. M9，為有效預(yù)防和控制熟制羊肉的微生物污染提供依據(jù)。

羊肉屠宰場(chǎng)；腐敗菌；芽孢桿菌；腐生葡萄球菌；致腐能力

近年來，羊肉深受消費(fèi)者的喜愛，作為一種高需求的肉制品，肉的品質(zhì)影響消費(fèi)者的選擇。羊肉在屠宰、加工、貯存和運(yùn)輸中易因微生物的污染而腐敗變質(zhì)[1-3]，因而屠宰加工環(huán)境的衛(wèi)生情況將直接影響羊肉的品質(zhì)[4]。周玉春[5]和王兆丹[6]等研究發(fā)現(xiàn)有效控制屠宰加工的環(huán)境衛(wèi)生，對(duì)保證肉品質(zhì)量起著積極的作用[7]。

市售羊肉中以冷鮮肉和熟制羊肉為主，國(guó)內(nèi)外對(duì)冷鮮肉及包裝肉制品中菌群鑒定及其相關(guān)腐敗菌的致腐能力研究較多[8]，例如Borch等[9]研究了冷鮮肉和加工肉制品中的腐敗細(xì)菌，包括假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、熱死環(huán)絲菌、腸桿菌科等，而熟制羊肉中腐敗菌的研究相對(duì)較少。煮制處理雖然能夠抑制微生物污染，起到防腐殺菌的作用，但是芽孢具有很強(qiáng)的抗高壓、抗化學(xué)藥物、抗輻射、抗熱性，它們可在高溫高壓的環(huán)境中存活下來[10-11]，當(dāng)條件適合時(shí)，芽孢繼續(xù)萌發(fā)為營(yíng)養(yǎng)體，致使產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，另外熟肉制品多通過簡(jiǎn)易的保鮮膜包裝銷售或在完全敞開的環(huán)境下銷售，也易受環(huán)境中微生物的污染，造成產(chǎn)品的貨架期很短，嚴(yán)重制約了熟肉品的生產(chǎn)和流通[12]。因此，通過對(duì)特定腐敗微生物致腐能力的測(cè)定，有利于人們采取更直接的策略和技術(shù)防止食品腐敗變質(zhì)。

為了研究微生物對(duì)羊肉的致腐能力，本研究通過對(duì)某羊屠宰場(chǎng)的屠宰環(huán)境及熟制品加工車間進(jìn)行微生物檢測(cè)和鑒定，選取3 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌Bacillus sp. M1、Staphylococcus saprophyticus M7、Bacillus sp. M9，分別接種熟制羊肉，無菌包裝，于7 ℃冷藏貯藏，比較各優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)熟制羊肉的致腐能力，從而為有效預(yù)防和控制熟制肉品的微生物污染提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

江蘇省蘇州市具有代表性的某羊屠宰場(chǎng)、熟制品加工車間。

培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 北京天根生物技術(shù)有限公司；rTaq DNA polymerase、Ds 2000 DNA Marker 日本TaKaRa公司；通用引物8F：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；1541R：5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA由上海生工生物工程有限公司合成；硼酸、氧化鎂、氯化鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UniCen MR臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Herolab公司；pHS-25B型數(shù)字酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；UV-6100型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；T-25數(shù)顯勻漿器 德國(guó)IKA公司；JS-600W電泳儀 上海培清科技有限公司；TP600梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 羊屠宰場(chǎng)和熟制品加工過程中的菌群分布

1.3.1.1 樣品采集

通過前期對(duì)屠宰過程的調(diào)研，主要對(duì)屠宰環(huán)境水、加工車間空氣、接觸面和肉制品進(jìn)行微生物檢測(cè)，樣品采集工藝流程如圖1所示。

圖1 羊屠宰場(chǎng)和熟制品加工過程的工藝流程Fig. 1 Flow diagram depicting mutton slaughter and processing of cooked products

屠宰環(huán)境水采樣：戴一次性無菌手套，取羊屠宰環(huán)境的水樣，取3 個(gè)重復(fù)樣。

加工車間空氣中微生物檢測(cè)[13-14]：對(duì)熟制品加工車間包括（冷卻間、煮制間、冷藏間、包裝間）進(jìn)行空氣檢測(cè)。將冷卻凝固的計(jì)數(shù)瓊脂平板開蓋置于不同房間4 個(gè)角落和中心位置5 min，然后于37 ℃培養(yǎng)。

接觸面、熟制品加工車間（臺(tái)面和托盤）的取樣：采用棉拭子涂抹法，參考雷志文[15]方法并做調(diào)整，將5 cm×5 cm標(biāo)準(zhǔn)滅菌規(guī)格板放在被檢托盤或臺(tái)面表面，用浸有生理鹽水的3 個(gè)棉拭子在規(guī)格板內(nèi)均勻涂抹整個(gè)方格，剪去手接觸部位后，將棉拭子放入盛有100 mL生理鹽水的三角瓶中，移動(dòng)規(guī)格板，涂抹4 次，使采樣面積達(dá)到100 cm2，將所有棉拭子放入三角瓶中，重復(fù)上述操作，取3 個(gè)重復(fù)樣，將樣品封口保存。

肉樣品取樣：對(duì)熟制品加工車間屠宰后（煮制前清洗前、煮制前清洗后、煮制后）的羊肉進(jìn)行取樣。將5 g肉樣無菌剪碎后置于45 mL已滅菌的生理鹽水中37 ℃搖床培養(yǎng)30 min，取3 個(gè)重復(fù)樣。

1.3.1.2 樣品中菌落總數(shù)的測(cè)定

菌落總數(shù)的檢測(cè)參照GB/T 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[16]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：挑出以上培養(yǎng)的熟制品加工車間空氣環(huán)境、接觸面、肉樣的單菌落進(jìn)行結(jié)晶紫染色后在普通顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

16S rDNA鑒定[17]：挑出以上培養(yǎng)的熟制品加工車間環(huán)境、接觸面、肉樣的單菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中培養(yǎng)，利用基因組提取試劑盒提取目標(biāo)菌株染色體DNA，并以此為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物8F：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；1541R：5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA擴(kuò)增目標(biāo)菌株的16S rDNA序列[18]。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果序列同源性分析利用BLAST軟件在線比對(duì)（http://www. ncbi.nlm.nih.Gov/blast/Blast.cgi）。用MEGA6.0軟件以Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 主要污染菌對(duì)熟制羊肉致腐能力的測(cè)定

1.3.3.1 主要污染菌的接種與熟制羊肉的貯藏

從市場(chǎng)上購(gòu)買新鮮的羊肉，高溫蒸煮后，于無菌環(huán)境分割成碎塊，每20 g一份分裝至無菌包裝袋中。取從熟制品加工車間分離的3 株優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行平板劃線，在適宜溫度條件下培養(yǎng) 24 h。挑取單菌落，過夜培養(yǎng)，按1%的接種量接種于300 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至菌液濃度達(dá)到7（lg（CFU/mL））時(shí)，經(jīng)適當(dāng)稀釋后按2～3（lg（CFU/mL））肉接種至分裝好的羊肉中，熱封封口，于7 ℃貯藏，每隔2 d取樣進(jìn)行后續(xù)調(diào)查[19]。

1.3.3.2 熟制羊肉于7 ℃貯藏過程中感官評(píng)定

由10 名感官評(píng)定人員采用10 分制進(jìn)行評(píng)分，羊肉感官指標(biāo)包含色澤、質(zhì)地和氣味，10 分為最好品質(zhì)，2 分為有表面暗深且有濃的腐臭味即腐敗點(diǎn)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[20]。

表1 7 ℃貯藏熟制羊肉的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of cooked mutton stored at 7 ℃

1.3.3.3 熟制羊肉于7 ℃貯藏過程中pH值的變化

取樣品2 g于離心管中加入18 mL蒸餾水勻漿（6 000 r/min）1 min，使用pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.3.3.4 熟制羊肉7 ℃貯藏過程中菌落總數(shù)[12]的變化

取樣品10 g加入到90 mL的生理鹽水中，10 倍梯度稀釋，利用平板計(jì)數(shù)對(duì)接種不同污染菌的肉進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.3.5 熟制羊肉7 ℃貯藏過程中揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）的變化

采用GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中半微量定氮法測(cè)定[21]。

1.3.3.6 腐敗能力的定量分析

將TVB-N產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU作為各污染菌腐敗能力的定量指標(biāo)[22-23]，以接種到無菌肉塊上的各腐敗菌的TVB-N產(chǎn)量來表示。腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU的計(jì)算公式為[24]：

式中：Ns、N0分別為為腐敗點(diǎn)、起始點(diǎn)的菌落總數(shù)/（CFU/g）；TVB-N0、TVB-Ns為起始點(diǎn)與腐敗點(diǎn)TVB-N含量/（mg N/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，3 次重復(fù)，取均值和標(biāo)準(zhǔn)差。Origin 8.0（Origin Lab公司）圖形分析處理軟件進(jìn)行圖形處理，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0（IBM公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)行顯著性比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊屠宰場(chǎng)和熟制品加工過程中的菌群分布

對(duì)羊屠宰場(chǎng)的屠宰環(huán)境及熟制品加工車間進(jìn)行微生物檢測(cè)，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明：屠宰水樣的菌落總數(shù)為4.80（lg（CFU/mL）），說明屠宰水樣污染較嚴(yán)重。熟制品加工車間空氣中細(xì)菌數(shù)見表2，各加工車間細(xì)菌數(shù)均低于10 CFU/皿，表明空氣質(zhì)量基本合格。但清洗車間、包裝車間和冷藏車間的細(xì)菌總數(shù)高于煮制車間和冷卻車間。所以清洗車間、包裝車間和冷藏車間的環(huán)境衛(wèi)生尚需進(jìn)一步提高。

由以上結(jié)果可知生鮮制品在煮制前需經(jīng)過清洗，以盡可能減少微生物的數(shù)量，不僅可以改善煮制過程中的殺菌效果，亦可減少煮制后生、熟制品交叉污染對(duì)熟制品造成的二次污染。本實(shí)驗(yàn)對(duì)清洗前后的肉樣進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)清洗前肉的菌落總數(shù)為5.22（lg（CFU/g）），清洗后肉的菌落總數(shù)為5.39（lg（CFU/g）），即清洗對(duì)生鮮肉微生物的污染未起到較好的減菌作用，這可能是與清洗肉的水反復(fù)利用，未及時(shí)更換，水樣已遭到嚴(yán)重污染有關(guān)，應(yīng)改為流動(dòng)水或提高更換清洗水的頻率。

在良好的衛(wèi)生程序中，對(duì)生產(chǎn)過程中與食品接觸的接觸物表面菌落總數(shù)規(guī)定的建議性標(biāo)準(zhǔn)[25-26]為在1.70（lg（CFU/cm2））以下為極滿意水平，1.70～5.00（lg（CFU/cm2））為可接受水平，達(dá)到5.00（lg（CFU/cm2））為不可接受水平。實(shí)驗(yàn)對(duì)熟制品加工過程中接觸面的微生物污染進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖2，接觸臺(tái)面菌落總數(shù)為3.64（lg（CFU/cm2））、接觸托盤為1.77（lg（CFU/cm2）），二者均在1.70～5.00（lg（CFU/cm2））之間為可接受水平。但接觸臺(tái)面菌落總數(shù)高于接觸托盤，且已接近不可接受水平的上限，說明接觸臺(tái)面污染較嚴(yán)重。調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，熟肉的菌落總數(shù)為3.23（lg（CFU/g）），這極有可能與污染較嚴(yán)重的接觸臺(tái)面接觸造成的二次污染有關(guān)。所以控制熟制品加工過程中清洗車間、包裝車間及冷藏車間的環(huán)境衛(wèi)生、接觸面（臺(tái)面、托盤）的微生物污染是防止熟制品微生物污染的主要途徑。

圖2 羊屠宰場(chǎng)的屠宰水樣、熟制品加工過程中接觸面、肉樣的菌落總數(shù)Fig. 2 Total colony number in water samples collected from mutton slaughterhouse and contact surfaces and cooked meat samples during processing

表2 熟肉加工車間空氣中的細(xì)菌數(shù)Table 2 Number of bacterial colonies detected in the air in cooked meat processing workshop

2.2 熟制品加工過程中污染菌群形態(tài)學(xué)觀察與鑒定

根據(jù)屠宰場(chǎng)的菌群分布狀況，選取了9 株（M1～M9）生長(zhǎng)代謝較旺盛、菌落形態(tài)有差異的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察（圖3）和16S rDNA鑒定。結(jié)果表明菌株形態(tài)各異，桿狀居多，初步斷定多數(shù)為桿菌，為進(jìn)一步確定污染菌株，提取分離的9 株菌的基因組DNA后，通過PCR擴(kuò)增獲得16S rDNA序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖4，發(fā)現(xiàn)目的片斷長(zhǎng)度約為1 700 bp，隨后將16S rDNA片段送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖3 熟制品加工過程中污染菌結(jié)晶紫染色后的顯微鏡圖片（×1 000）Fig. 3 Microscopic image of contaminating bacteria during processing of cooked meat (× 1 000)

圖4 熟制品加工過程中污染菌16S rDNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 4 PCR amplified products of 16S rDNA gene of contaminating bacteria during processing of cooked meat

圖5 熟制品加工過程菌群基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of different contaminating bacterial strains during processing of cooked meat based on 16S rDNA sequences

將16S rDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，初步鑒定，M1、M3為Bacillus，M2為β-變形菌（Beta proteobacterium），M4為金黃桿菌（Chryseobacterium profundimaris），M6為嗜糖小細(xì)菌（Microbacterium saccharophilum），M7為Staphylococcus saprophyticus，M9為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。M5、M8與嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。16S rDNA最高序列一致性僅為75%，因此二者可能與已報(bào)道的菌種差異較大，有可能是新型菌種。

經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖5），M1、M3、M9與B. aryabhattai，M7與S. saprophyticus，M2、M4、M6與各相應(yīng)已鑒定的菌種位于同一分支。M5與M8位于單獨(dú)的分支，這與BLAST比對(duì)結(jié)果是一致的。

熟制品加工過程中芽孢桿菌為主要的污染菌株，并且在熟肉和接觸托盤中均被鑒定出。原因是該菌能形成芽孢，耐高溫、耐低溫、耐強(qiáng)酸、耐強(qiáng)堿、對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)。而煮制肉的溫度達(dá)不到殺死芽孢的溫度，一旦條件允許，芽孢萌發(fā)，致使熟制羊肉中仍存在芽孢桿菌。S. saprophyticus在熟肉制品與煮制間、包裝間被檢出。S. saprophyticus是常見的腐敗菌，其存在于熟制品加工環(huán)境中可能是由于生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生不達(dá)標(biāo)所致。在熟肉制品及接觸臺(tái)面、冷藏庫(kù)、包裝間中仍有Beta proteobacterium、C. profundimaris和M. saccharophilum非優(yōu)勢(shì)腐敗菌的檢出，原因也應(yīng)與加工過程環(huán)境衛(wèi)生未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。

2.3 主要污染菌對(duì)熟制羊肉致腐能力的測(cè)定

根據(jù)熟肉加工過程中各菌落分布與生長(zhǎng)狀況，選取3 株主要污染菌Bacillus sp. M1、S. saprophyticus M7、Bacillus sp. M9接種熟制羊肉，于7 ℃貯藏，進(jìn)行致腐能力測(cè)定。

2.3.1 熟制羊肉貯藏過程中感官評(píng)定

對(duì)貯藏期內(nèi)接種不同污染菌的熟制羊肉進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖6所示。隨著熟制羊肉貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，接種3 株污染菌的熟制羊肉其腐敗程度均加劇，感官可接受性逐步降低，在12 d時(shí)均達(dá)到腐敗點(diǎn)，0～12 d為不可接受范圍之內(nèi)。在貯藏過程中，接種Bacillus sp. M1的熟制羊肉感官評(píng)分略低于接種其他2 株菌的感官評(píng)分，但未呈現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。

圖6 接種污染菌的熟制羊肉在7 ℃貯藏過程中感官變化Fig. 6 Change in sensory quality of cooked mutton inoculated with different spoilage bacteria during storage at 7 ℃

2.3.2 熟制羊肉貯藏過程中pH值的變化

圖7 接種污染菌的熟制羊肉在7 ℃貯藏過程中pH值的變化Fig. 7 Change in pH of cooked mutton inoculated with different spoilage bacteria during storage at 7 ℃

對(duì)貯藏期內(nèi)接種不同污染菌的熟制羊肉進(jìn)行pH值測(cè)定，結(jié)果如圖7所示。貯藏前期（0～6 d），pH值逐漸下降，這可能與污染菌產(chǎn)生一些酸類物質(zhì)有關(guān)，而貯藏中后期（6～15 d），pH值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這可能與隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)熟制肉中產(chǎn)生一些胺類物質(zhì)[25]，對(duì)pH值的影響高于酸類物質(zhì)有關(guān)。但接種3 種腐敗菌后熟制羊肉pH值在9 d時(shí)呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)未呈現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3.3 熟制羊肉貯藏過程中菌落總數(shù)的變化

肉中細(xì)菌的數(shù)量是表示其腐敗程度的重要指標(biāo)，熟制羊肉在貯藏過程中各污染菌菌落總數(shù)的變化如圖8所示。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)各腐敗菌菌落總數(shù)逐漸增加，且在第3～6天增加迅速，在第6天時(shí)，接種Bacillus sp. M1和S. saprophyticus M7的熟制羊肉的菌落總數(shù)達(dá)到6.72（lg（CFU/g））和6.71（lg（CFU/g）），這與黎園園等[20]研究第5天時(shí)解凍豬肉已產(chǎn)生強(qiáng)烈的腐臭味，熱死環(huán)絲菌菌數(shù)達(dá)到6.62（lg（CFU/g））相似。后隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落總數(shù)持續(xù)緩慢增加。接種Bacillus sp. M1和S. saprophyticus M7的熟制羊肉菌落總數(shù)無明顯差異（P＞0.05），但二者明顯高于接種Bacillus sp. M9的熟制羊肉菌落總數(shù)（P＜0.05）。

圖8 接種污染菌的熟制羊肉在7 ℃貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Fig. 8 Change of in total colony number of cooked mutton inoculated with different spoilage bacteria during storage at 7 ℃

2.3.4 熟制羊肉貯藏過程中TVB-N值的變化

TVB-N值指肉及肉制品水浸液在堿性條件下能與水蒸汽一起蒸餾出來的總氮量，是評(píng)價(jià)肉制品新鮮度的一項(xiàng)重要指標(biāo)，TVB-N是由于微生物感染并繁殖，進(jìn)入肌肉組織內(nèi)部，并分泌一系列酶從而引起脫氨、脫羧作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解而形成的產(chǎn)物[27]。如圖9所示，在貯藏過程中，各接種菌組TVB-N值隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在GB 2707—2005《鮮（凍）畜肉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定TVB-N值應(yīng)不高于15 mg/100 g，熟制羊肉在貯藏6～9 d時(shí)TVB-N值增加迅速，并且在貯藏第6天時(shí)TVB-N值已超過15 mg/100 g。所以貯藏第6天時(shí)污染菌致腐性已明顯顯現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中，接種Bacillus sp. M1和S. saprophyticus M7的熟制羊肉TVB-N值要顯著（P＜0.05）高于接種Bacillus sp. M9的肉品TVB-N值。

圖9 接種污染菌的熟制羊肉在7 ℃貯藏過程中TVB-N值的變化Fig. 9 Change in TVB-N of cooked mutton inoculated with different spoilage bacteria during storage at 7 ℃

2.3.5 腐敗能力的定量分析

污染菌的致腐敗能力用腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子（YTVB-N/CFU）表示，即貨架期終點(diǎn)時(shí)單位數(shù)量污染菌產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物量的多少。由于不同腐敗菌利用分解肉品中蛋白質(zhì)產(chǎn)生的代謝物不同，引起肉品腐敗的程度和特性的不同。YTVB-N/CFU可定量地表示每種優(yōu)勢(shì)腐敗菌在相同時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生TVB-N的量，由此可反映不同優(yōu)勢(shì)腐敗菌導(dǎo)致羊肉腐敗能力的差異[28-30]。由表3可看出，Bacillus sp. M1的YTVB-N/CFU為1.39×10-6mg/CFU，略高于S. saprophyticus M7的1.32×10-6mg/CFU，且二者顯著高于Bacillus sp. M9的1.90×10-7mg/CFU。因此，Bacillus sp. M1和 S. saprophyticus M7的致腐能力顯著高于Bacillus sp. M9，且Bacillus sp. M1的致腐能力略高于S. saprophyticus M7。這正與前文中感官評(píng)分（圖6）、菌落總數(shù)（圖8）、TVB-N值（圖9）的變化基本相符。

表3 接種各污染菌的熟制羊肉在7 ℃貯藏過程中初始點(diǎn)及腐敗點(diǎn)的菌落總數(shù)、TVB-N值及產(chǎn)量因子Table 3 Total colony number and TVB-N value and yield factors of microbial metabolites at the initial time point and at the time of spoilage in cooked mutton inoculated with different contaminating bacteria during storage at 7 ℃

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)江蘇省蘇州市具有代表性的某羊屠宰場(chǎng)的屠宰環(huán)境及熟制品加工車間進(jìn)行微生物檢測(cè)，重點(diǎn)對(duì)熟制品加工過程中包括接觸面（接觸托盤、接觸臺(tái)面）和清洗前后的生肉與煮制后的肉進(jìn)行微生物檢測(cè)，確定熟制品加工過程中污染菌群的分布。煮制之前的清洗未能起到很好的減菌作用，且熟制品加工過程中接觸面污染也較嚴(yán)重致使交叉污染使熟制羊肉的菌落總數(shù)達(dá)到3.23（lg（CFU/cm2））。所以改良清洗流程及控制熟制品加工過程中接觸面衛(wèi)生是控制肉制品被微生物污染的重要步驟。

對(duì)熟制品加工過程中污染的菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所污染的腐敗菌主要為芽孢桿菌、腐生葡萄球菌、變形桿菌、金黃桿菌和微桿菌等，根據(jù)各菌落分布與生長(zhǎng)狀況，選取3 株主要污染菌Bacillus sp. M1、S. saprophyticus M7、Bacillus sp. M9接種熟制羊肉，通過對(duì)熟制羊肉的感官評(píng)定、pH值、菌落總數(shù)、TVB-N值和腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子的測(cè)定來鑒定它們對(duì)熟制羊肉的致腐能力。最終得出Bacillus sp. M1和S. saprophyticus M7的致腐能力顯著高于Bacillus sp. M9，且菌株Bacillus sp. M1的致腐能力略高于S. saprophyticus M7。為后續(xù)對(duì)熟制羊肉中主要的污染菌群進(jìn)行針對(duì)性的靶向抑制，以延長(zhǎng)熟制羊肉的貨架期提供參考。

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Distribution of the Main Contaminating Bacteria in Mutton Slaughter and Processing Plant and Their Potential for Cooked Mutton Spoilage

WANG Xiaomeng1,2, SUN Zhilan1,*, ZHU Yongzhi1, BIAN Huan1, WU Haihong1, LIU Fang1, JIANG Yun2, WANG Daoying1, XU Weimin1,3
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. Department of Food Science, Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 3. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing, Quality and Safety Control, Nanjing 210095, China)

Microbial samples collected from a representative mutton slaughter and processing plant in Suzhou, Jiangsu province, China were detected. This study mainly focused on the processing of cooked products, including the contact surfaces of cooking workshop, the air in each processing workshop, raw meat before and after washing and cooked meat. The aim was to determine the distribution of contaminating microbiota during the industrial production of cooked meat products. Bacterial counts of all the air samples were lower than 10 CFU per plate, respectively, being in line with the air quality standards. However, the total colony number of cooked meat reached 3.23(lg(CFU/cm2)) due to cross-contamination with the seriously polluted contact surfaces of cooking workshop. The contaminating spoilage bacteria were identified to be mainly Bacillus, Staphylococcus saprophyticus, Proteobacterium, Chryseobacterium and Microbacterium based on a combination of morphology and 16S rDNA sequences. Subsequently, three dominant spoilage bacteria, Bacillus sp. M1, S. saprophyticus M7 and Bacillus sp. M9, were selected to evaluate their potential for cooked mutton spoilage by detecting sensory scores, pH value, total colony number, total volatile basic nitrogen value and yield factors of microbial metabolites. The results suggested that Bacillus sp. M1 displayed the strongest spoilage potential, followed by S. saprophyticus M7 and Bacillus sp. M9. This study may provide a theoretical basis for microbial pollution control of cooked mutton products.

mutton slaughter plant; spoilage bacteria; Bacillus; Staphylococcus saprophyticus; spoilage potential

10.7506/spkx1002-6630-201716042

中圖分類號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-6630（2017）16-0261-07

2016-06-12

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（15）1007）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371802）

王筱夢(mèng)（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：625196221@qq.com

*通信作者：孫芝蘭（1984—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槿馄钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：zhilan408@163.com

王筱夢(mèng), 孫芝蘭, 諸永志, 等. 羊肉屠宰加工場(chǎng)主要污染菌的分布及其對(duì)熟制羊肉的致腐能力[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 261-267. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716042. http://www.spkx.net.cn

WANG Xiaomeng, SUN Zhilan, ZHU Yongzhi, et al. Distribution of the main contaminating bacteria in mutton slaughter and processing plant and their potential for cooked mutton spoilage[J]. Food Science, 2017, 38(16): 261-267. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716042. http://www.spkx.net.cn