馬 清，蔡 瑞，姜風(fēng)超，馬立娟,2,*，杜麗平,2，肖冬光,2

N-糖基化對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中異源表達(dá)的影響

馬 清1，蔡 瑞1，姜風(fēng)超1，馬立娟1,2,*，杜麗平1,2，肖冬光1,2

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300457）

為研究N-糖基化對里氏木霉β-甘露聚糖酶（β-mannanase，Man1）在畢赤酵母GS115中異源表達(dá)的影響，采用定點突變的方法，將Man1上3 個N-糖基化修飾位點（N131、N158和N329）上的天冬酰胺用中性谷氨酰胺取代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N-糖基化位點的突變對Man1的轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響，突變后獲得的Man1表觀分子質(zhì)量有輕微下降，與Man1相比，3 個突變體N131、N158和N329的甘露聚糖酶活力分別降低了85.43%和79.48%和16.3%；而熱穩(wěn)定性分別提高了7.87%、13.5%和15.37%。由此可見，N-糖基化修飾對于β-甘露聚糖酶的高效表達(dá)是必需的，其中N131和N158糖基化位點尤為重要，但是會稍微降低β-甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性。

β-甘露聚糖酶；N-糖基化；定點突變；酶活力；熱穩(wěn)定性

β-甘露聚糖酶（β-1,4-mannanase，EC3.2.1.78）能夠水解β-1,4-D-甘露糖苷鍵連接的葡萄甘露聚糖、甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖及半乳甘露聚糖等底物[1]，是一種僅次于木聚糖酶的第二大半纖維素酶類，在飼料、食品、造紙、制藥等各個領(lǐng)域均具有廣闊的應(yīng)用前景[2-6]，近年來對于它的研究也逐漸成為了國內(nèi)外的研究熱點。β-甘露聚糖酶在自然界的來源比較廣泛，包括動物[7]、植物[8-10]和微生物[11-12]，其中主要的來源是微生物。由于微生物具有生長周期短、易于培養(yǎng)和產(chǎn)酶能力強等優(yōu)點[13]，其已成為工業(yè)化生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的主要“加工廠”。里氏木霉（Trichoderma reesei）作為生產(chǎn)纖維素酶與半纖維素酶的優(yōu)良菌種[14]，目前對其分泌的β-甘露聚糖酶Man1在畢赤酵母（Pichia pastoris）中表達(dá)的研究不多。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種高效的外源蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)，通常存在蛋白質(zhì)的糖基化修飾[15]，N-糖基化是真核生物所特有的糖基化修飾。N-糖基化修飾是β-構(gòu)型的N-乙酰葡糖胺異頭C原子與天冬酰胺（Asn）的γ-酰胺N原子共價連接而成的N-糖苷鍵的修飾[16]。β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中表達(dá)的主要翻譯后修飾為N-糖基化修飾，氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr（Xaa是除了脯氨酸的任意氨基酸、Ser為絲氨酸、Thr為蘇氨酸）被認(rèn)為是N-糖基化的特征序列[17]。研究表明，N-糖基化修飾既可增加也可減少糖蛋白的穩(wěn)定性，這取決于糖基化修飾發(fā)生的位置，當(dāng)糖基化修飾發(fā)生在折疊有序的區(qū)域時，會減少其穩(wěn)定性，而當(dāng)糖基化修飾發(fā)生在混亂無序的位置時則會増加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[18]。例如，Guo Meijin等[19]研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母重組肌醇六磷酸酶在90 ℃條件下處理10 min可維持40%的酶活力，而去糖基化后在40 ℃條件下處理10 min酶活力劇烈下降；Xi Hongxing等[20]也發(fā)現(xiàn)N-糖基化修飾的亮氨酸氨基肽酶具有較高的熱穩(wěn)定性和催化效率。此外，Wang Changqing等[21]的研究也表明糖蛋白的去N-糖基化修飾雖然不會改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，但會降低蛋白質(zhì)熱失活過程的可逆性，導(dǎo)致熱變性過程中蛋白質(zhì)的聚集，這也進(jìn)一步闡明了N-糖基化修飾可提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的原因。但是，也有文獻(xiàn)報道糖基化修飾不會顯著影響酶的熱穩(wěn)定性甚至?xí)蛊錈岱€(wěn)定性降低。齊飛飛[22]發(fā)現(xiàn)里氏木霉纖維二糖水解酶Ⅰ的不同位點上的糖基化對酶分子的熱穩(wěn)定性的影響不同，N384位的糖基化能顯著提高酶的熱穩(wěn)定性，N45和N270位點的糖基化對熱穩(wěn)定性無顯著影響。Han Minghai等[23]通過定點突變用Asn-Xaa-Thr取代了Asn-Xaa-Ser氨基酸序列，增強了重組彈性蛋白酶的N-糖基化程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)N212和N280位點突變使彈性蛋白酶活力分別提高了43%和25%，而N36位點突變則降低了31%。而Vaquero等[24]發(fā)現(xiàn)在酯酶成熟肽的N-糖基化修飾對酶的活性沒有任何影響。謝春芳等[25]利用生物信息學(xué)方法涉及并引入N-糖基化突變位點對假蜜環(huán)菌來源的β-甘露聚糖酶進(jìn)行了分子改造，發(fā)現(xiàn)N-糖基化對該酶的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和蛋白酶抗性均有改善。因此，有必要研究N-糖基化修飾對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中表達(dá)的影響，以便進(jìn)一步優(yōu)化重組β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)，滿足其在各個領(lǐng)域的應(yīng)用。

本研究采用NetNGlyc 1.0 Server軟件在線分析里氏木霉β-甘露聚糖酶Man1中易發(fā)生N-糖基化修飾的位點，利用定點突變技術(shù)，將里氏木霉β-甘露聚糖酶N-糖基化修飾位點上的Asn用中性谷氨酰胺（Gln）取代。比較突變體表達(dá)的酶與非突變體表達(dá)的酶的轉(zhuǎn)錄水平，酶活力水平和熱穩(wěn)定性等特性，進(jìn)而探討N-糖基化對里氏木霉β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中異源表達(dá)的影響，為β-甘露聚糖酶的定向改造提供理論依據(jù)從而有利于對其進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

里氏木霉（T. reesei Rut）C30、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、畢赤酵母GS115由天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點實驗室保藏；重組載體pPIC9K-Man1為本實驗室構(gòu)建并保存，其中Man1基因來源于里氏木霉。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；刺槐豆膠、十二磺基磺酸鈉 美國Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、山梨醇、生物素、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，yNB） 北京Solarbio公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、甲醇、甘油 天津市化學(xué)試劑一廠；咪唑 天津市化學(xué)試劑三廠；D-甘露糖 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；酵母提取物、蛋白胨 英國Oxoid公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑、限制性內(nèi)切酶、Marker大連寶生物公司。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCl 1%；yPD培養(yǎng)基：酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%；BMGy培養(yǎng)基：酵母提取物1%、蛋白胨2%、yNB 1.34%、甘油1%、生物素4×10-5%；BMMy培養(yǎng)基：酵母提取物1%、蛋白胨2%、yNB 1.34%、甲醇0.5%、生物素4×10-5%。

1.3 儀器與設(shè)備

HE-120多功能水平電泳槽、HE-120多功能垂直電泳槽 上海天能科技公司；hS-1300-V型超凈臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PCT-200型PCR基因擴增儀美國Bio-Rad公司；全自動凝膠成像儀 美國Syngene公司；H1650-W臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；5430R型4 ℃離心機 德國艾本德股份公司；H2Q-C搖床 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；ECM830電轉(zhuǎn)化儀 美國BTX公司；紅外激光成像系統(tǒng) 美國LI-COR公司；StepOne型熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀 美國ABI公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 軟件分析β-甘露聚糖酶Man1中易發(fā)生N-糖基化的位點

采用NetNGlyc 1.0 Server軟件在線分析里氏木霉β-甘露聚糖酶Man1中易發(fā)生N-糖基化修飾的位點并選擇其中閾值超過0.5的位點進(jìn)行下一步研究。

1.4.2 突變載體的構(gòu)建

利用定點突變試劑盒將N-糖基化位點上編碼天冬酰胺Asn的位點（AAT或AAC）突變?yōu)榫幋a中性Gln的位點（CAA）。以大腸桿菌擴增后的重組質(zhì)粒pPIC9K-Man1為模板，通過上游引物MF和下游引物MR對質(zhì)粒進(jìn)行擴增。本實驗所用引物見表1，均利用oligo7軟件設(shè)計并由金唯智公司合成。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸9 min，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。取擴增產(chǎn)物40～50 μL加入1 μL DpnⅠ，混勻后在37 ℃恒溫反應(yīng)1～2 h，以去除模板質(zhì)粒，用瓊脂糖凝膠電泳檢測消化后的產(chǎn)物并進(jìn)行切膠回收。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of primers used in this study

重組反應(yīng)體系（20 μL）為：ddH2O 2 μL、5×CEⅡ Buffer 4 μL、DpnⅠ消化產(chǎn)物12 μL、ExnaseⅡ 2 μL。將各組分混勻后置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后立即置于冰浴中冷卻5 min，所得到的產(chǎn)物即為突變質(zhì)粒。用得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，用含有氨芐的LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑取陽性單克隆到液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與pPIC9KMan1比對以確定是否突變成功。

1.4.3 畢赤酵母重組菌株的構(gòu)建與篩選

將經(jīng)過測序后確認(rèn)構(gòu)建成功的突變載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacⅠ線性化后各取20 μL與80 μL畢赤酵母GS115感受態(tài)混合，混勻后，轉(zhuǎn)入冰預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯，冰上放置5 min后電擊（1 500 V、25 μF、200 Ω、6 ms）轉(zhuǎn)化，結(jié)束后迅速加入1 mL冰預(yù)冷的無菌1 mol/L山梨醇至杯中，于超凈臺內(nèi)將所有溶液轉(zhuǎn)至滅菌離心管中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)1 h后取200 μL涂布于MD平板，30 ℃培養(yǎng)48～72 h至單克隆產(chǎn)生。

挑取MD板轉(zhuǎn)化子依次點于含不同質(zhì)量濃度G418（1、2、4 mg/mL）的yPD培養(yǎng)基平板上，30 ℃分別培養(yǎng)48 h，以篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。將篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子挑取到5 mL yPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、240 r/min培養(yǎng)16～18 h后提取重組酵母基因組DNA進(jìn)一步鑒定。

1.4.4 甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)

挑取篩選得到并驗證正確的高拷貝單克隆，接種至含25 mL BMGy的250 mL搖瓶中，30 ℃、240 r/min培養(yǎng)至OD600nm為2～6（約16～18 h）。用滅菌離心管，4 ℃、3 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用BMMy重懸細(xì)胞至OD600nm為1.0進(jìn)行誘導(dǎo)。每24 h取樣，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集上清液進(jìn)行酶活力測定。為補償甲醇的揮發(fā)損失，每24 h補加甲醇至體積分?jǐn)?shù)為0.5%，直至達(dá)到最佳的誘導(dǎo)時間。

1.4.5 突變體轉(zhuǎn)錄水平的測定

本實驗通過qRT-PCR方法比較3 種重組突變體與重組pPIC9K-Man1產(chǎn)甘露聚糖酶轉(zhuǎn)錄水平的差異。

將3 種重組突變體與重組pPIC9K-Man1在同一條件下進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，72 h后提取重組菌體，用RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別提取4 種菌體的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板通過qRT-PCR進(jìn)行定量比較。

qRT-PCR體系（20 μL）為：SyBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL、10 μmol M F 0.8 μL、10 μmol M R 0.8 μL、50×ROX reference dye 0.4 μL、cDNA 2 μL、H2O 6 μL。以3-磷酸甘油醛脫氫酶基因GAP為內(nèi)參基因，不加入模板為陰性對照以排除其他成分污染的影響，重組pPIC9KMan1（甲醇誘導(dǎo)2 h的甘露聚糖酶）表達(dá)量為陽性對照，即定義為1。所有的PCR樣品進(jìn)行3 次重復(fù)，重復(fù)水平的方差作為誤差。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃延伸30 s，60 ℃ 20 s，40 個循環(huán)；程序循環(huán)95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。

1.4.6 突變體酶活力的測定

將3 種重組突變體與重組pPIC9K-Man1在同一條件下進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24 h補甲醇至0.5%并取樣，5 000 r/min離心5 min取上清液作為粗酶液。用DNS法[26]測酶活力：取誘導(dǎo)上清液200 μL與1.8 mL底物0.5%刺槐豆膠溶液（50 mmol/L pH 5.0的檸檬酸鈉緩沖液配制）于試管中混勻，以200 μL檸檬酸鈉緩沖液作空白對照，置于60 ℃水浴反應(yīng)5 min，流水冷卻，加入3 mL DNS溶液，加熱煮沸5 min。冷卻后在540 nm波長處測吸光度，以D-甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶活力定義：在pH 5.0、60 ℃的條件下，以每分鐘生成相當(dāng)于1 μmol/L D-甘露糖所需的酶量為一個酶活力單位，用IU/mL表示。

1.4.7 突變體和非突變體重組甘露聚糖酶的純化

在誘導(dǎo)168 h后，將4 種重組體的發(fā)酵液4 ℃、5 000 r/min離心5 min取上清液并用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白質(zhì)。將上清液用0.22 μm濾膜過濾后加載到柱上，用含有pH 7.9 Tris-HCl和0.5 mmol/L NaCl的不同濃度咪唑溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為40、60、80、100、200、300、500 mmol/L。最后得到的純化樣品置于8～14 kD透析膜中用50 mmol/L檸檬酸緩沖液進(jìn)行透析以置換出咪唑。將得到的蛋白質(zhì)存于4 ℃條件下進(jìn)行后續(xù)分析。

取部分純化后的樣品通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[27]進(jìn)行分析。

1.4.8 突變體熱穩(wěn)定性的測定

將純化的4 種甘露聚糖酶適當(dāng)稀釋后，分別在70 ℃保溫15、30、45、60 min，用DNS法測定3 種突變體和重組pPIC9K-Man1表達(dá)的β-甘露聚糖酶Man1的剩余酶活力，以最高甘露聚糖酶活力為100%，其他條件下的酶活力占最高酶活力的百分比為該酶在溫度處理后的相對酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化位點的預(yù)測

用NetNGlyc 1.0 Server軟件在線分析里氏木霉β-甘露聚糖酶Man1中易發(fā)生N-糖基化修飾的位點。由圖1、表2可知，Man1中共有5 個天然N-糖基化位點（Asn-Xaa-Ser/ Thr），其中閾值超過0.5的分別是N131、N158和N329，對其進(jìn)一步研究。

圖1 N-糖基化位點預(yù)測Fig. 1 Predicted N-glycosylation sites

表2 Man1序列N-糖基化位點預(yù)測結(jié)果Table 2 Predicted N-glycosylation sites of Man1

2.2 突變載體的構(gòu)建與鑒定

2.2.1 突變載體的構(gòu)建

圖2 定點突變PCR擴增Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of mutant genes obtained by site-directed mutation

以重組pPIC9K-Man1為模板進(jìn)行PCR擴增后得到線性的目的質(zhì)粒，由圖2可知，條帶1～3可能是所需的目的基因片段。然后通過瓊脂糖凝膠回收試劑盒對目的條帶進(jìn)行純化回收后，用DpnⅠ消化去除甲基化模板pPIC9K-Man1，用ExnaseⅡ催化使目的基因環(huán)化，即得到3 種突變重組質(zhì)粒pPIC9K-N131、pPIC9K-N158和pPIC9K-N329。經(jīng)大腸桿菌DH5α擴增后的重組質(zhì)粒pPIC9K-Man1是經(jīng)過甲基化修飾的，而PCR擴增產(chǎn)生的DNA片段不帶甲基化修飾，DpnⅠ酶的識別位點被甲基化后才能被識別切割，即DpnⅠ酶只能識別甲基化的模板鏈而不能識別PCR產(chǎn)物鏈，因此通過DpnⅠ酶消化就能把模板DNA鏈和新合成的PCR產(chǎn)物鏈區(qū)分開[28]。然后在ExnaseⅡ催化下擴增產(chǎn)物5′末端和3′末端由于存在15～21 bp反向互補區(qū)域可以發(fā)生同源重組，完成擴增產(chǎn)物的環(huán)化過程，即得到了環(huán)狀的突變重組載體。

2.2.2 重組質(zhì)粒的驗證

用構(gòu)建成功的3 種突變重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，經(jīng)氨芐抗性篩選后提取陽性轉(zhuǎn)化子，挑取單克隆培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后將質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序結(jié)果與pPIC9KMan1序列進(jìn)行比對，結(jié)果如圖3所示。N-糖基化修飾的特征氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr中編碼Asn的位點（AAT或AAC）均已突變?yōu)榫幋a中性的谷氨酰胺的位點（CAA），其他序列均與模板保持一致，這一結(jié)果說明3 個糖基化位點均已成功突變，3 種突變重組載體已構(gòu)建成功。

圖3 突變序列的比對Fig. 3 Sequence alignment between mutant strains and pPIC9K-Man1

2.3 3 種重組突變體與重組Man1的比較

2.3.1 轉(zhuǎn)錄水平的比較

圖4 甘露聚糖酶轉(zhuǎn)錄水平的比較Fig. 4 Comparison of transcriptional expression levels of recombinant mannanases

通過進(jìn)行qRT-PCR比較3 種畢赤酵母重組突變體與重組Man1在甲醇誘導(dǎo)72 h后產(chǎn)甘露聚糖酶轉(zhuǎn)錄水平的差異，結(jié)果如圖4所示。4 種重組菌體甘露聚糖酶的轉(zhuǎn)錄水平無明顯差異，卻均比重組Man1甲醇誘導(dǎo)2 h后產(chǎn)甘露聚糖酶轉(zhuǎn)錄水平高7～9 倍，說明N-糖基化修飾對重組甘露聚糖酶的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)無明顯影響，而甲醇誘導(dǎo)時間對重組甘露聚糖酶的影響較大。

2.3.2 酶活力水平的比較

圖5 4 種重組體產(chǎn)甘露聚糖酶活力和菌體生長曲線Fig. 5 Time-courses for mannanase production and the growth of recombinant strains

將篩選正確的3 種畢赤酵母重組突變體pPIC9K-N131、pPIC9K-N158和pPIC9K-N329與重組pPIC9K-Man1在同等條件下進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，結(jié)果如圖5所示。隨著誘導(dǎo)時間的延長，甘露聚糖酶活力和菌體OD600nm也逐漸升高，然而在4 種重組體的菌體量與上清液中總蛋白質(zhì)量濃度（1.2 mg/mL左右）均無顯著差異的條件下，重組甘露聚糖酶活力卻有很大不同，即去N-糖基化修飾的3 種突變體分泌的甘露聚糖酶活力與重組Man1相比均有所下降，其中N131、N158分泌的重組酶活力下降幅度比較大，分別為85.43%、79.48%，而N329與Man1相比酶活力下降幅度不大，僅為16.3%。突變后造成酶活力降低的原因可能是因為糖基化修飾可以通過改變蛋白質(zhì)的整體構(gòu)象從而影響構(gòu)象決定的所有功能，如蛋白質(zhì)的正確折疊，如果糖基化受到抑制，那么蛋白質(zhì)不能正確折疊因而達(dá)不到應(yīng)有的功能狀態(tài)[29]。

2.3.3 純化后的SDS-PAGE分析

圖6 突變體和原重組酶的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of recombinant mannanases

pPIC9K-N131、pPIC9K-N158和pPIC9K-N329與重組pPIC9K-Man1分泌的4 種β-甘露聚糖酶經(jīng)鎳柱純化后，進(jìn)行進(jìn)一步SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖6所示，4 種重組甘露聚糖酶均呈單一條帶，再一次驗證了3 種畢赤酵母突變體已成功構(gòu)建并成功表達(dá)了目的蛋白。3 種重組突變體與重組pPIC9K-Man1表達(dá)的蛋白質(zhì)相比表觀分子質(zhì)量略有下降，這可能是因為畢赤酵母分泌的蛋白質(zhì)大多數(shù)為N-連接糖基化高甘露糖型，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后會一定程度上增加寡糖鏈長度。而增加的長度約為平均每個支鏈8～14 個甘露糖殘基，即去N-糖基化修飾后分子質(zhì)量約降低1～3 kD[30]。因此從圖中可以看出3 種突變體與原重組體Man1相比，表觀分子質(zhì)量僅有輕微的下降。

2.3.4 熱穩(wěn)定性的比較

將3 種重組突變體和原重組體Man1在70 ℃分別處理不同時間，DNS法測相對酶活力，結(jié)果如圖7所示，4 種重組甘露聚糖酶（Man1、N131、N158和N329）的相對酶活力均隨處理時間的延長而劇烈下降，處理60 min后分別下降至13.82%、21.69%、27.32%和29.19%。而與原重組體Man1相比，3 種突變體（N131、N158和N329）熱穩(wěn)定性分別提高了7.87%、13.5%和15.37%。酶在某一溫度條件下的半衰期是指將酶在某個溫度保存不同時間，測其在不同時間的剩余酶活力，當(dāng)剩余酶活力為初始酶活力50%時對應(yīng)的時間。從圖7可知，4 種重組甘露聚糖酶（Man1、N131、N158和N329）在70 ℃的半衰期的大小順序為：N329＞N158＞Man1＞N131，但是在相對酶活力下降到50%之后Man1的下降速率明顯高于N131，所以1 h后Man1的剩余活力最小。由此可見，這3 個位點的N-糖基化位點突變可以在一定程度上增強畢赤酵母中異源表達(dá)的β-甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性，即這3 個位點的糖基化會降低該重組酶的熱穩(wěn)定性，這可能是因為這3 個位點的糖基化影響了酶的局部結(jié)構(gòu)的改變，使其變?yōu)橄鄬Σ荒蜔岬慕Y(jié)構(gòu)，因而降低了它的熱穩(wěn)定性。

圖7 突變體和原重組酶的熱穩(wěn)定性比較Fig. 7 Comparison of thermal stability of recombinant mannanases

3 結(jié) 論

本實驗成功構(gòu)建了畢赤酵母突變體N131、N158和N329，并且將它們所表達(dá)的β-甘露聚糖酶在表觀分子質(zhì)量、酶活力、轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)及熱穩(wěn)定性等方面與重組Man1分泌的甘露聚糖酶進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 種突變重組甘露聚糖酶均能在畢赤酵母GS115中成功表達(dá)，且3 種突變體分泌的甘露聚糖酶純化后測得的表觀分子質(zhì)量因其位點突變而有輕微的下降。突變后重組甘露聚糖酶在轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]發(fā)生明顯變化，而在同一條件下3 種突變體（N131、N158和N329）的酶活力與重組Man1相比分別下降了85.43%、79.48%和16.3%，但熱穩(wěn)定性卻分別提高了7.87%、13.5%和15.37%。可見N-糖基化修飾會在一定程度上增強畢赤酵母中異源表達(dá)的β-甘露聚糖酶活力，輕微降低它的穩(wěn)定性，使表觀分子質(zhì)量輕微增大，對酶轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)無明顯影響。

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Effect of N-Glycosylation on the Heterologous Expression of β-Mannanase in Pichia pastoris

MA Qing1, CAI Rui1, JIANG Fengchao1, MA Lijuan1,2,*, DU Liping1,2, XIAO Dongguang1,2
(1. Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. Tianjin Food Safety & Low Carbon Manufacturing Collaborative Innovation Center, Tianjin 300457, China)

In order to investigate the influence of N-glycosylation on the expression of β-mannanase from Trichoderma reesei (Man1) in Pichia pastoris GS115, the asparagine (Asn) residues at three N-linked glycosylation sites (N131, N158 and N329) of Man1 were substituted by neutral glutamine (Gln) through site-directed mutagenesis. The results showed that mutations of the N-glycosylated sites had no significant effects on the expression of Man1 at the transcriptional level.

Compared with Man1, the apparent molecular mass of the mutant Man1 decreased slightly, and the activities of the mutants (N131, N158 and N329) decreased by 85.43%, 79.48% and 16.3%, respectively. However, the thermal stability of mutant N131, N158 and N329 increased by 7.87%, 13.5% and 15.37% compared to that of Man1. Therefore, N-glycosylation especially at N131 and N158 was essential for the high-level expression of Man1 in P. pastoris GS115, but led to a slight reduction in the thermal stability of Man1.

β-mannanase; N-glycosylation; site-directed mutagenesis; enzyme activity; thermal stability

10.7506/spkx1002-6630-201716013

Q55

A

1002-6630（2017）16-0086-06

馬清, 蔡瑞, 姜風(fēng)超, 等. N-糖基化對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中異源表達(dá)的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 86-91. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716013. http://www.spkx.net.cn

MA Qing, CAI Rui, JIANG Fengchao, et al. Effect of N-glycosylation on the heterologous expression of β-mannanase in Pichia pastoris[J]. Food Science, 2017, 38(16): 86-91. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716013. http://www.spkx.net.cn

2016-10-20

天津科技大學(xué)青年教師創(chuàng)新基金項目（2014CXLG10）；工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業(yè)微生物重點實驗室（天津科技大學(xué)）開放基金項目（2014IM101）；天津市自然科學(xué)基金重點項目（16JCZDJC31800）

馬清（1993—），女，碩士研究生，研究方向為酶與分子生物學(xué)。E-mail：399491057@qq.com

*通信作者：馬立娟（1981—），女，助理研究員，博士，研究方向為生物質(zhì)資源綜合利用、食品微生物發(fā)酵。

E-mail：malj@tust.edu.cn