闞文翰,紀曉雯,王玉婷,梅林,王志耕

(安徽農(nóng)業(yè)大學 茶與食品科技學院,安徽 合肥,230036)

研究報告

酪蛋白磷酸肽鋅螯合肽的分離及結(jié)構(gòu)性質(zhì)表征

闞文翰,紀曉雯,王玉婷,梅林,王志耕*

(安徽農(nóng)業(yè)大學 茶與食品科技學院,安徽 合肥,230036)

酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides，CPPs)是一類具有二價金屬元素螯合活性的多肽集，而定向獲得特異性營養(yǎng)元素螯合活性的酪蛋白磷酸肽具有理論和實際意義。采用Q強陰離子交換色譜和高效反相制備色譜(RP-HPLC)連續(xù)色譜方案分離堿性蛋白酶酶解得到的CPPs，獲得鋅高螯合活性的CPPs，并運用氨基酸組成、紫外光譜、紅外光譜、固體核磁共振13C譜、1H譜、31P譜表征分析酪蛋白磷酸肽螯合鋅(CPP-Zn)的螯合性質(zhì)。結(jié)果表明：CPPs經(jīng)連續(xù)色譜分離可得具有高鋅螯合活性的肽，其鋅螯合活性可達88.68 μg/mg。螯合前后CPPs的結(jié)構(gòu)及氨基酸組成發(fā)生了明顯變化，其中的磷酸基團參與了螯合，推測其主要結(jié)合位點是—COOH、—NH2及P—OH中的—OH。

酪蛋白磷酸肽；分離；鋅；螯合；結(jié)構(gòu)

CPPs是一類來源于酪蛋白(含有α-酪蛋白、β-酪蛋白、γ-酪蛋白)的含有磷酸基團的肽集[1]，通?？梢酝ㄟ^特定蛋白酶解得到，現(xiàn)有的研究多以N/P比、多肽含量等理化指標來衡量CPPs活性。但目前針對其螯合鋅離子的螯合活性的研究還很少。大量的研究表明[2-5],CPPs具有多種生理功能，其中促進礦物質(zhì)吸收和利用生理活性功能備受關(guān)注。鋅是動物機體代謝中不可或缺的微量營養(yǎng)素之一，鋅營養(yǎng)不足是全球性的人類健康問題。目前，市面上的補鋅劑大多是無機鋅鹽和有機酸鋅鹽，此類補鋅劑存在生物利用率不高，攝入后容易在腸道中與植酸、草酸、磷酸等形成不溶性鋅鹽沉淀，從而降低了鋅的生物利用率等問題。[6]新材料酪蛋白磷酸肽螯合鋅以鋅離子為中心，通過與電負性強的基團如氨基和羰基及羧基結(jié)合形成螯合環(huán)結(jié)構(gòu)，從而避免了鋅離子在堿性腸道環(huán)境產(chǎn)生沉淀而損失[7-8]，可顯著提高鋅離子在消化系統(tǒng)中的穩(wěn)定性、吸收利用率及生物活性，極具開發(fā)利用前景。有效獲得高螯合活性的CPPs是CPP-Zn制備的前提，定向酶解、高效分離純化、螯合物結(jié)構(gòu)特征表征等研究對CPP-Zn螯合機制解析及實現(xiàn)高效制備均具有重要意義。

本研究利用堿性蛋白酶水解酪蛋白得到CPPs，采用色譜分離獲得較強鋅螯合活性的CPPs，并對其結(jié)構(gòu)性質(zhì)進行表征。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

酪蛋白(98%)，AMRESCO；堿性蛋白酶(alkaline protease酶活力10 000 U),RUIBIO公司；Q Sepharose FF填料,瑞典GE公司；BCA試劑盒,南京建成生物研究所；ZnSO4(AR),西隴化工股份有限公司；色譜空柱(20cm×15.0mm)，瑞典GE公司；透析袋(100 Da)，美國光譜公司；uRPC C2/C18ST4.6/100反相制備型色譜柱，瑞典GE公司； Gamma1-16 LSC冷凍干燥機，德國Marin Christ公司；ZEEnit 700p 原子吸收分光光度計：德國Analytik Jena公司；Nicolette is50 傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo Scientific公司；AKTA UPC 10快速蛋白純化平臺，瑞典GE公司；pH計：上海梅特勒托利多儀器有限公司；電子天平(精度：0.001)，上海奧豪斯儀器有限公司；AVANCE III 500核磁共振波譜儀：瑞士Bruker 公司；L-8800氨基酸自動分析儀，日本日立；PE-Lambda紫外分光光度計，美國perkinElmer公司。

1.2CPPs的制備

取適量酪蛋白，將其配制成質(zhì)量分數(shù)7%的蛋白底物溶液，0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至10.0，以每250 g酪蛋白溶液添加0.07 g堿性蛋白酶的比例加酶，55 ℃酶解3 h。酶解液于100 ℃水浴8 min滅酶處理，再用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至4.6，3 500r/min離心15 min，取上清，添加0.1 mol/L CaCl2溶液，使CaCl2終含量為1%，靜置1 h，加入等體積的體積分數(shù)95%乙醇，8 000 r/min離心15 min，收集CPPs沉淀物，凍干備用。

1.3鋅螯合活性的測定

1 mL 0.05 mol/L的Zn2+溶液，加入1 mL酪蛋白磷酸肽酶解液，60 ℃水浴80 min，再加入1 mL去離子水和1 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 7.0)，室溫靜置5 min，10 000 r/ min冷凍離心15 min，無水乙醇洗滌沉淀5次，用雙硫腙試劑檢測洗液無變色反應(yīng)，即排除游離鋅干擾。采用BCA法及原子吸收光譜法分別測定沉淀物中多肽含量P、鋅螯合量C[9-10]，由此計算CPPs組份鋅螯合活性。

鋅螯合活性=C/P

(1)

式中：C，鋅螯合量，μg；P,多肽含量,mg。

1.4鋅螯合肽的分離

將CPPs配制成0.1 g/mL的溶液，采用兩步法分離純化高鋅螯合活性肽。

首先，取適量Q sepharose FF填料填柱，用平衡相(A相)pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡15個柱體積至UV基線穩(wěn)定，上樣量10 mL，用(B相)pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液含有1 mol/L NaCl的溶液作為洗脫相進行洗脫分離操作，于洗脫程序0～10 min 100%A相,10～50 min 0～100%B相，流速0.5 mL/min，5 min/管，214 nm下收集各峰，按1.3方法檢測各收集管洗脫液對鋅離子的相對螯合活性，獲得鋅螯合活性最強的CPPs組分。將收集的洗脫液置于透析袋(100 Da)中，4 ℃去離子水脫鹽24 h，每10 h更換透析外液，脫鹽后凍干備用。

第二步，將上步獲得的鋅螯合活性最強的CPPs組分，用制備型RP-HPLC色譜進一步分離。流動相A相為0.1%TFA的水溶液，B相為0.1%TFA水溶液V(乙腈)∶V(水)=6∶4，用A相平衡20個柱體積至UV基線穩(wěn)定。上樣量0.5 mL，按洗脫程序0～10min 100%A相，10～30 min 0%～70%B相，30～50 min 70%～0% B相，流速0.1 mL/min，2 min/管，214 nm條件下收集各吸收峰的洗脫液，按1.3方法檢測獲得鋅螯合活性最強的洗脫液組分，凍干備用。

1.5CPP-Zn的制備

取適量純化CPPs，用去離子水配制成0.1g/mL CPPs溶液，40 ℃10 min保溫溶解，用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，按CPPs∶Zn(質(zhì)量比)=4∶1比例添加可溶鋅，于60 ℃反應(yīng)80 min，以8 000 r/min離心15 min，沉淀物用無水乙醇洗滌，經(jīng)60 ℃熱風干燥，制得CPP-Zn。

1.6氨基酸組成分析

準確稱取上文得到的CPPs、CPP-Zn各10 mg，放入消化管中，加入12 mL 6mol/L的HCl并充入N2，置于120 ℃烘箱中水解10 h，用氨基酸自動分析儀測定其中氨基酸組成及含量。

1.7紫外光譜分析

將上文得到的CPPs以及CPP-Zn配制成1.0 mg/mL的水溶液，在200～400 nm下進行紫外掃描。

1.8紅外光譜分析

分別將制備色譜純化獲得的高螯合活性CPPs及CPP-Zn粉末，在50 ℃條件下烘至恒重，各取1 mg晶體，在瑪瑙研缽中加入100 mg KBr研磨，壓片，抽氣加壓，壓力約為600 kg/cm2，維持3～5 min，卸壓得透明KBr樣品片，用傅里葉紅外光譜儀在4 000～500 cm-1區(qū)間內(nèi)掃描。

1.913C、1H和31P固體核磁共振分析

取適量制備色譜純化后的CPPs及CPPs-Zn粉末，進行固體核磁共振分析，13C、1H和31P MAS NMR試驗均在AVANCE AVIII WB 500寬腔固體核磁共振波譜儀(500 MHz)上進行，其共振頻率分別為100.63、400.14和161.98 Hz。

13CMAS NMR結(jié)合單脈沖實驗下采用2.5 mm三共振MAS探頭進行采樣，轉(zhuǎn)速為5 kHz，接觸時間2 ms，采樣時間5 ms，延遲時間5 ms，傳感器對信號譜峰采集圖像次數(shù)為1 000。

1H MAS NMR結(jié)合單脈沖實驗下采用2.5 mm三共振MAS探頭進行采樣，魔角旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為5 kHz，采樣時間5 ms，延遲時間5 ms，傳感器對信號譜峰采集圖像采集次數(shù)128。

31P MAS NMR結(jié)合高功率去耦實驗下采用4 mm 三共振MAS 探頭進行采樣，轉(zhuǎn)速15 000 r/s，采樣時間50.2 ms，延遲時間2 s，傳感器對信號譜峰采集圖像采集次數(shù)10 k。13C、1H和31P的固體核磁化學位移分別以甘氨酸、TMS(四甲基硅烷)和85%H3PO4為外標進行校零。

2 結(jié)果與討論

2.1酪蛋白磷酸肽鋅螯合肽的分離

CPPs酶解物經(jīng)Q Sepharose FF陰離子交換色譜柱分離出峰結(jié)果如圖1-a，各組分經(jīng)鋅螯合活性測定結(jié)果表明，峰3具有最高的鋅螯合活性。再將峰3組分進一步經(jīng)過RP-HPLC色譜分離(圖1-b)，經(jīng)活性測定發(fā)現(xiàn)，峰3組分鋅螯合活性最高，命名為CPP-33。兩步分離純化獲得高鋅螯合活性CPPs的效果參見表1。

圖1 高鋅螯合活性酪蛋白磷酸肽分離純化效果Fig.1 Separation and purification of zinc-high-chelating activity Casein Phosphate

表1 高鋅螯合活性酪蛋白磷酸肽兩步分離純化效果

2.2高鋅螯合活性CPPs螯合前后的氨基酸組成分析

高螯合活性CPPs及CPP-Zn粉末的氨基酸組成分析結(jié)果參見表2。

表2 高鋅螯合活性酪蛋白磷酸肽螯合前后的氨基酸組成

當Zn2+與CPPs螯合時，對CPPs整體構(gòu)象產(chǎn)生影響，由于氨基酸的極性與側(cè)鏈基團的差異，對金屬離子的親和能力會有所不同，所以Zn2+會對其具有較強的親和能力的氨基酸中的—NH4、—COOH中的N、O形成配位鍵，單位空間里，當Zn2+與氨基酸配位，原有氨基酸總量發(fā)生變化，因此螯合前后氨基酸的組成含量會有不同。

CPPs、CPP-Zn 進行氨基酸組成分析如表2所示，螯合前后酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)等芳香族氨基酸的含量減少，分別由3.74%降低到1.99%，2.87%降低到1.25%，且螯合后氨基酸總量減少了9.06%，減少的部分可能由Zn2+代替，變化趨勢同張智[7]一致，芳香族氨基酸的結(jié)果變化與后文中核磁共振13C譜的變化推導一致。

2.3高鋅螯合活性CPPs螯合前后的紫外光譜分析

圖2 高鋅螯合活性酪蛋白磷酸肽螯合前后紫外吸收光譜圖Fig.2 UV-VIS spectra of zinc-high-chelating activity of Caseinphos Phate before and after chelate

2.4高鋅螯合活性CPPs的紅外光譜分析

高螯合活性CPPs及CPP-Zn粉末的紅外光譜檢測結(jié)果參見圖3。

圖3 高螯合活性酪蛋白磷酸肽螯合前后紅外光譜圖Fig. 3 The infrared spectra of zinc-high-chelating activity of Casein Phosphate before and after chelate

螯合前后譜圖的形狀變化主要表現(xiàn)在1 406.99 cm-1(6)處，該處在螯合前后曲線變化顯著。另螯合前曲線的1 535.51 cm-1(4)處，螯合后，出峰位置藍移至1 551.56 cm-1(4)，該變化提示游離的—NH2可能與Zn2+發(fā)生了鍵合反應(yīng)。1 406.99 cm-1(6)在螯合后曲線中減弱消失，且CPP-Zn中3 400 cm-1附近吸收峰變窄，說明CPP-Zn 結(jié)構(gòu)中無裸露的—COOH 結(jié)構(gòu)，—COOH 已與Zn2+結(jié)合，這與周亮[11]結(jié)果相似。

2.5高鋅螯合活性CPPs的固體核磁共振分析

高螯合活性CPPs及CPP-Zn的13C、1H和31P固體核磁共振分析結(jié)果參見圖4～圖6。

圖4 高鋅螯合活性酪蛋白磷酸肽螯合前后13C核磁共振譜圖Fig.4 13C NMR spectra of zinc-high-chelating activity Casein Phosphate before and after chelate

圖5 高鋅螯合活性酪蛋白磷酸肽螯合前后1H 核磁共振譜圖Fig. 5 1H NMR spectra of zinc-high-chelating activity Casein Phosphate before and after chelate

圖6 高鋅螯合活性酪蛋白磷酸肽螯合前后31P核磁共振譜圖Fig.6 31P NMR spectra of zinc-high-chelating activity Casein Phosphate before and after chelate

由圖4可知，CPPs螯合前后均存在5種場區(qū)的譜峰，其中位于23 ppm以內(nèi)場區(qū)的譜峰，多來自于脂肪族氨基酸側(cè)鏈甲基上的C原子貢獻，位于23～50 ppm場區(qū)的峰，主要由脂肪族氨基酸的亞甲基上的C原子產(chǎn)生；位于165～180 ppm場區(qū)的寬峰多是包含氨基酸骨架上羰基上的C原子產(chǎn)生。

螯合前后譜圖的變化主要在60 ppm左右以及100 ppm左右峰的消減和位移。位于50～70 ppm場區(qū)的譜峰是包含肽鏈骨架上的C原子貢獻而成，螯合前后該場區(qū)發(fā)生較多峰的位移以及消減，由此猜測CPPs與Zn2+螯合后形成多元螯合環(huán)結(jié)構(gòu)，在其配位鍵的作用下導致肽鏈的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。而位于100～140 ppm場區(qū)內(nèi)的譜峰均由芳香族氨基酸中的C原子產(chǎn)生，此處譜峰的變化提示苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)等芳香族氨基酸的多肽參與了Zn2+的螯合，原有C原子的化學環(huán)境的改變，從而導致峰面積和峰高的消減。

由圖5可見，CPPs在-24 ppm附近質(zhì)子信號發(fā)生耦合，譜峰裂解產(chǎn)生多重峰，在-19.5 ppm附近質(zhì)子信號表現(xiàn)為雙峰。結(jié)果表明，當CPPs和Zn2+螯合后，Zn2+與CPPs上的—COOH鍵合作用，影響了不同位置上H 的化學環(huán)境，致使H 自旋偶合產(chǎn)生的裂解峰發(fā)生了位移變化，使氫核周圍電子云密度發(fā)生變化。當電子云密度變大時，受到電子屏蔽效應(yīng)強，共振頻率降低，化學位移減??；當H 核周圍電子云密度變小時，化學位移則增大。圖5中，2.11 ppm處譜峰化學位移減小至2.02 ppm且?guī)捉В瑧?yīng)是由于游離-NH2與Zn2+發(fā)生螯合后，質(zhì)子峰向高場移動所致。

由圖6可知，CPPs螯合前后均存在5種化學環(huán)境的P原子，各譜峰由磷酸化氨基酸的磷酸基團提供。圖6中螯合前后譜峰(3)的化學位移發(fā)生了變化，從-24.09 ppm向低場移動至-22.80 ppm，這種化學位移變化取決于其核周圍電子云密度的大小的變化。在螯合過程中，CPPs所含的磷酸基團P—OH的H被金屬離子Zn2+取代后，與P直接相連的O變成了氧負離子，使其電負性增大，其核外的電子云密度發(fā)生降低，產(chǎn)生了去屏蔽作用，從而導致31P的化學位移向低場發(fā)生移動[12]。此外CPPs發(fā)生螯合反應(yīng)前后的31P MAS NMR 的譜峰(3)的峰值和面積也發(fā)生了明顯的變化，螯合后的曲線明顯低于螯合前的曲線，這說明在CPPs與Zn2+的螯合過程中，磷酸基團的P—OH參與了螯合反應(yīng)。

3 結(jié)論

酪蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解，經(jīng)Q Sepharose FF陰離子交換色譜與RP-HPLC色譜法兩步分離，獲得高鋅螯合活性的CPPs，其螯合活性達88.68 μg/mg。CPPs與CPPs-Zn經(jīng)氨基酸組成分析、紫外光譜、紅外光譜以及固體核磁共振13C譜、1H譜、31P譜解析，結(jié)果表明，螯合前后CPPs的結(jié)構(gòu)及氨基酸組成發(fā)生了明顯變化，其中的磷酸基團參與了螯合，其主要結(jié)合位點是—COOH、—NH2及P—OH中的—OH。

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Separationandstructurecharacterizationsofzinc-bindingpeptidefromCaseinPhosphopeptides

KAN Wen-han, JI Xiao-wen, WANG Yu-ting, MEI Lin,WANG Zhi-geng*

(School of Tea and Food Science& Technology, Anhui Agriculture University, Heifei 230036，China)

Casein Phosphopeptides (Casein Phosphopeptides, referred to as CPPs) is a class of polypeptides which has divalent metal chelating activity. The theory and practical significance of CPPs is its specific nutrient chelated. CPPs was obtained by enzymatic hydrolysis, and separated Q strong anion exchange chromatography and reverse phase preparative chromatography (RP-HPLC); it had highly active zinc chelate peptide(CPP-Zn). Its structural was analyzed by proportion of amino acids、UV-VIS spectra、infrared spectroscopy、13C NMR spectra、1H NMR spectra and31P NMR spectra. Result: CPP purified from continuous chromatographic separation had strong zinc chelating ability of 88.68ug / mg. Structure analysis showed CPP structure and proportion of amino acids before and after chelation significantly changed. The phosphate groups are involved in the chelation, —COOH、—NH2and —OH in P—OH were the primary binding site.

Casein Phosphopeptides; isolated; zinc; chelate; structure

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013274

碩士研究生(王志耕教授為通訊作者，E-mail：wzhg@ahau.com.cn)。

2016-10-26，改回日期：2017-02-22