王凌霄，王培福，才麗娜，黃 佳，張 晨，彭代輝，方貽儒

·論著·

慢性應激行為與大鼠海馬、前額葉區(qū)細胞外信號調節(jié)蛋白激酶信號通路激活的關系研究

王凌霄1，王培福1，才麗娜1，黃 佳2，張 晨2，彭代輝2，方貽儒2

目的 探討慢性應激行為與大鼠海馬、前額葉區(qū)細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路激活的關系。方法 2011年6月—2012年8月將50只成年清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為對照組12只、藥物組12只及應激組26只。對照組大鼠不給予任何刺激，藥物組和應激組大鼠給予8周應激刺激，藥物組大鼠于應激刺激第1周開始給予鹽酸氟西汀皮下注射。各組大鼠于造模開始前、造模結束后1 d進行糖水偏好實驗和曠場試驗，應激刺激結束后采用Western bloting法檢測各組大鼠海馬、前額葉區(qū)ERK、磷酸化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(P-ERK)蛋白表達情況。結果 應激刺激過程中共11只大鼠死亡，其中正常對照組2只、藥物組4只、應激組5只。根據糖水偏好實驗結果將應激組大鼠分為應激適應組(n=6)和應激敏感組(n=15)。造模開始前4組大鼠跨格次數(shù)、直立次數(shù)及中心格停留時間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模結束后1 d，藥物組、應激適應組和應激敏感組大鼠跨格次數(shù)、直立次數(shù)少于對照組，中心格停留時間長于對照組(P<0.05)，應激敏感組大鼠跨格次數(shù)少于藥物組(P<0.05)。應激刺激結束后，4組大鼠海馬、前額葉區(qū)ERK蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。應激刺激結束后，應激敏感組大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達量低于藥物組和應激適應組(P<0.05)，而藥物組和應激適應組大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 慢性應激刺激可導致大鼠自主活動水平下降，鹽酸氟西汀可在一定程度上降低慢性應激刺激對大鼠自主活動水平的影響，海馬和前額葉區(qū)ERK信號通路激活可能與大鼠應激適應有關。

應激，心理學；細胞外信號調節(jié)蛋白激酶類；海馬；前額葉區(qū)；大鼠

王凌霄，王培福，才麗娜，等.慢性應激行為與大鼠海馬、前額葉區(qū)細胞外信號調節(jié)蛋白激酶信號通路激活的關系研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2017，25(7)：57-61.[www.syxnf.net]

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心理應激是抑郁癥的主要發(fā)病原因之一。臨床研究顯示，遭受嚴重創(chuàng)傷后大部分人表現(xiàn)為應激適應，10%～40%的人表現(xiàn)為應激障礙或情緒障礙[1]。應激適應是指個體在遭受急性或慢性應激、創(chuàng)傷時成功適應逆境的能力[2]。目前，有關應激適應的分子機制研究較少。有研究表明，海馬部位腦源性神經生長因子(brain derived neurophic factor，BDNF)水平與大鼠應激適應有關，提示神經營養(yǎng)因子信號通路可能參與介導應激適應[3]。

細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路是BDNF與受體結合后激活的重要信號通路之一，其在細胞分裂、增殖、分化、存活及神經可塑中具有重要調節(jié)作用[4]。動物實驗及臨床研究表明，海馬區(qū)ERK信號通路激活與抑郁癥發(fā)病機制及抗抑郁藥物作用機制相關[5-7]。近期一項研究發(fā)現(xiàn)，抑制腹側被蓋區(qū)ERK信號通路激活可使大鼠發(fā)生應激適應，提示特定腦區(qū)的ERK信號通路可能參與調節(jié)不同應激行為[8]。本研究立足于神經營養(yǎng)因子失調假說，旨在探討慢性應激行為與大鼠海馬、前額葉區(qū)ERK信號通路激活的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2011年6月—2012年8月選用清潔級雄性Sprague-Dawlwy大鼠50只，由上海復旦大學醫(yī)學院動物科學實驗中心提供，入組時體質量100～300 g，曠場實驗(觀察大鼠在3 min內穿越實驗敞箱的底面塊數(shù)及后肢直立次數(shù)的垂直活動得分)結果相近，購回后在實驗室動物房適應性飼養(yǎng)3 d，維持室溫22.0 ℃，人工明/暗12 h/12 h晝夜節(jié)律(光照時間9：00～21：00)，單籠飼養(yǎng)(鼠籠40 cm×25 cm×20 cm)，自由飲水及攝食。本研究中所有實驗操作遵守《中華人民共和國實驗動物管理條例》及《上海市實驗動物管理條例》。將大鼠隨機分為對照組12只、藥物組12只、應激組26只。

1.2 主要試劑和實驗儀器 曠場實驗觀察箱(自制木箱：寬100 cm，高50 cm，底面用黑線劃分為25個10 cm×10 cm的方格)，F(xiàn)ujifilm LAS-3000曝光機(日本)，10%聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳及轉膜裝置(美國Bio-Rad公司)，NC膜(美國millipore公司)，戊巴比妥(上?；瘜W試劑有限公司)，蛋白裂解液(碧云天)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit)，Western電化學發(fā)光劑(electrogenerated chemiluminescence，ECL)(碧云天)，鼠源性ERK單克隆抗體(Santa Cruz公司)；兔源性磷酸化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(P-ERK)1/2單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，β-actin一抗(美國Cell Signaling公司)，HRP標記鼠二抗(碧云天)，HRP標記兔二抗(碧云天)。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立慢性應激模型 根據KATZ等[9]方法建立慢性應激模型。藥物組和應激組大鼠均給予8周應激刺激，單籠飼養(yǎng)，每天給予以下1或2種刺激：禁水24 h，禁食24 h，濕墊料24 h，強迫游泳5 min，夾尾1 min，斜籠24 h，光照24 h；藥物組大鼠于應激刺激第1周開始給予鹽酸氟西汀10 mg/g皮下注射，持續(xù)治療8周；對照組大鼠不給予任何刺激。

1.3.2 曠場實驗 各組大鼠于造模開始前、造模結束后1 d進行曠場實驗，具體步驟如下：依次將每只大鼠輕放入箱子中心格中觀察其5 min內的自主活動，記錄跨格次數(shù)、直立次數(shù)、中心格停留時間。實驗結束后用酒精棉球擦拭箱子去除氣味。

1.3.3 糖水偏好實驗[3]各組大鼠于造模開始前、造模結束后1 d進行糖水偏好實驗，具體步驟如下：實驗開始前給予大鼠斷水斷糧24 h(9：00～次日9：00)，每籠給予1瓶純水和1瓶1%蔗糖水，實驗前稱重，放置籠上1 h后再次稱重，1 h內兩個水瓶位置隨機變換，實驗結束后計算糖水偏愛率，糖水偏愛率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。其中以糖水偏愛率<基線值40%定義為應激敏感，以糖水偏愛率≥基線值40%定義為應激適應。

1.3.4 Western bloting法 糖水偏好實驗結束后立即斷頭處死大鼠，快速分離海馬及前額葉皮質，采用蛋白裂解液提取蛋白，儲存于-80 ℃冰箱中。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白水平，10%PAGE凝膠電泳分離樣品蛋白質，蛋白質轉移至NC膜，封閉液室溫封閉1 h，采用含0.5%Tween-20的Tris緩沖鹽(TBST)洗膜5 min×3次。加入鼠源性ERK單克隆抗體、兔源性P-ERK1/2單克隆抗體，4 ℃搖晃過夜，TBST洗膜5 min×3次。辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體孵育，室溫1 h，TBST洗膜5 min×3次。加入Western ECL，LAS-3000曝光機顯影。使用Quantity one軟件計算蛋白條帶灰度值，將對照組蛋白條帶灰度值作為參考，分別計算藥物組、應激敏感組、應激適應組大鼠海馬和前額葉區(qū)ERK及P-ERK蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 實驗結果 應激刺激過程中共11只大鼠死亡，其中對照組2只、藥物組4只、應激組5只。根據糖水偏好實驗結果將應激組大鼠分為應激適應組(n=6)和應激敏感組(n=15)。

2.2 曠場實驗結果 造模開始前4組大鼠跨格次數(shù)、直立次數(shù)及中心格停留時間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模結束后1 d 4組大鼠跨格次數(shù)、直立次數(shù)及中心格停留時間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中藥物組、應激適應組、應激敏感組大鼠跨格次數(shù)和直立次數(shù)少于對照組，中心格停留時間長于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；應激敏感組大鼠跨格次數(shù)少于藥物組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.3 大鼠海馬及前額葉區(qū)ERK蛋白表達情況 應激刺激結束后，4組大鼠海馬、前額葉區(qū)ERK蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2)。

Table 2 Comparison of relative quantity expression of ERK protein in hippocampus and prefrontal cortex among the four groups of rats

組別只數(shù)海馬區(qū)ERK蛋白相對表達量前額葉區(qū)ERK蛋白相對表達量對照組101.001.00藥物組81.06±0.120.83±0.21應激適應組61.20±0.200.72±0.04應激敏感組150.94±0.060.93±0.01F值2.541.87P值>0.05>0.05

注：ERK=細胞外信號調節(jié)蛋白激酶

表1 4組大鼠造模前后曠場實驗結果比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與藥物組比較，bP<0.05

2.4 大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白表達情況 應激刺激結束后，4組大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中應激敏感組大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達量低于藥物組和應激適應組(P<0.05)；藥物組和應激適應組大鼠海馬及前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3、圖1)。

Table 3 Comparison of relative quantity expression of P-ERK protein in hippocampus and prefrontal cortex among the four groups of rats

組別只數(shù)海馬區(qū)P-ERK蛋白相對表達量前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達量對照組101.001.00藥物組81.33±0.13a1.05±0.60a應激適應組61.02±0.11a0.91±0.30a應激敏感組150.69±0.080.60±0.15F值3.330.85P值<0.05<0.05

注：P-ERK=磷酸化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶；與應激敏感組比較，aP<0.05

注：P-ERK=磷酸化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶

圖1 4組大鼠海馬和前額葉區(qū)P-ERK蛋白電泳圖

Figure 1 Electrophoretogram of P-ERK protein in hippocampus and prefrontal cortex of the four groups of rats

3 討論

目前，有關個體應激適應能力的相關研究主要針對抵抗應激能力的社會心理因素，如積極情緒、自我調節(jié)能力、社會競爭力等[10]。近年來，應激適應的生物學機制逐漸引起臨床關注。本研究通過檢測不同應激行為大鼠海馬及前額葉區(qū)ERK信號通路表達情況，旨在探討不同應激反應的生物學機制。

糖水偏好實驗是檢測實驗動物興趣度減退程度的臨床實驗，曠場實驗是檢測實驗動物自主活動水平的臨床實驗[11-12]。本研究結果顯示，藥物組、應激適應組及應激敏感組大鼠跨格次數(shù)、直立次數(shù)少于對照組，中心格停留時間長于對照組，提示慢性應激刺激可導致大鼠自主活動水平下降，與KRISHNAN等[13]研究結果相一致。

目前，關于抑郁癥動物模型ERK蛋白表達情況的研究結果存在分歧。有研究結果顯示，慢性應激動物模型及抑郁癥患者腦組織ERK蛋白水平下降[14-16]；也有研究結果顯示，慢性強迫游泳刺激大鼠和對照大鼠海馬區(qū)ERK蛋白水平間無差異[17]，分析各研究結果間存在差異的可能原因為應激種類、應激強度及應激持續(xù)時間不同。本研究結果顯示，4組大鼠海馬和前額葉區(qū)ERK蛋白相對表達量間無差異，提示海馬和前額葉區(qū)ERK蛋白表達與慢性應激行為無關。

大量研究證實，慢性應激刺激可抑制抑郁癥大鼠海馬、前額葉區(qū)ERK信號通路激活[16]，表明局部腦組織ERK信號通路激活抑制可能與抑郁癥發(fā)病機制有關。目前，關于應激適應大鼠ERK信號通路激活的研究報道較少。本研究結果顯示，應激敏感組大鼠海馬、前額葉區(qū)P-ERK蛋白相對表達量低于應激適應組，提示海馬、前額葉區(qū)ERK信號通路激活可能參與調控不同慢性應激行為。ERK蛋白磷酸化通過激酶級聯(lián)途徑可激活一系列下游轉錄因子，如環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cyclic-AMP-responsive element-binding protein，CREB)，CREB激活后與靶基因結合可導致BDNF表達增加，進而參與神經再生或神經可塑性的調控。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性應激適應大鼠海馬區(qū)BDNF mRNA表達水平高于慢性應激敏感大鼠[3]；大鼠海馬齒狀回處BDNF過度表達可表現(xiàn)出應激適應行為和抗抑郁效應[18]。以上研究提示BDNF表達增加與應激適應行為有關，且大鼠海馬和前額葉區(qū)ERK信號通路激活導致的不同慢性應激行為可能與調控神經再生或神經可塑性相關。

既往研究結果顯示，持續(xù)給予氟西汀可使大鼠腦組織P-ERK水平升高[19]，ERK信號通路阻斷劑可抑制抗抑郁藥物及BDNF的抗抑郁效果[20-22]，提示ERK信號通路激活參與抗抑郁藥物的起效機制。本研究結果顯示，應激敏感組大鼠跨格次數(shù)少于藥物組，提示鹽酸氟西汀可在一定程度上降低慢性應激刺激對大鼠自主活動水平的影響，筆者據此推測應激適應可能與抗抑郁藥物起效過程具有相似的分子信號機制，但仍有待于進一步研究證實。

綜上所述，慢性應激刺激可導致大鼠自主活動水平下降，鹽酸氟西汀可在一定程度上降低慢性應激刺激對大鼠自主活動水平的影響，海馬和額葉區(qū)ERK信號通路激活可能與大鼠應激適應有關。

作者貢獻：王凌霄、王培福、彭代輝進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文；彭代輝、方貽儒指導論文修改并對文章負責；才麗娜、黃佳、張晨協(xié)助進行試驗實施、評估、資料收集。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：謝武英)

Relationship between Chronic Stress Behaviors and ERK Signal Pathway Activation of Hippocampus and Prefrontal Cortex in Rats

WANGLing-xiao1，WANGPei-fu1，CAILi-na1，HUANGJia2，ZHANGChen2，PENGDai-hui2，F(xiàn)ANGYi-ru2

1.AerospaceCentralHospital，Beijing100092，China2.MentalHealthCenterofShanghai，Shanghai200030，ChinaCorrespondingauthor：FANGYi-ru，E-mail：yirufang@aliyun.comPENGDai-hui，E-mail：pdhsh@126.com

Objective To explore the relationship between chronic stress behaviors and ERK signal pathway activation of hippocampus and prefrontal cortex in rats.Methods From June 2011 to August 2012,A total of clear 50 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into A group(n=12)，B group(n=12)and C group(n=26)，thereinto rats of A group did not

any stress stimulation，rats of B group and C group received stress stimulation for 8 weeks，meanwhile rats of B group received subcutaneous injection of fluoxetine hydrochloride at the first week of stress stimulation.Sucrose preference test and open-field test were carried out before modeling and after 1 day of modeling，Western bloting method was used to detect the protein expressions of ERK and P-ERK of hippocampus and prefrontal cortex after stress stimulation.Results A total of 11 rats died during the stress stimulation，including 2 rats in A group，4 rats in B group and 5 rats in C group.Rats of C group were divided into C1 group(with stress adaptation，n=6)and C2 group(with stress sensitive，n=15) according to sucrose preference test.No statistically significant differences of striding grid times，upright times or central square stays was found among the four groups(P>0.05)；after 1 day of modeling，striding grid times，upright times of B group，C1 group and C2 group were statistically significantly less than those of A group，central square stays of B group，C1 group and C2 group was statistically significantly longer than that of control group，meanwhile striding grid times of C2 group was statistically significantly less than that of B group(P<0.05).No statistically significant differences of relative quantity expression of ERK protein of hippocampus or prefrontal cortex was found among the four groups after stress stimulation(P>0.05).After stress stimulation，relative quantity expression of P-ERK protein of hippocampus and prefrontal cortex of C2 group was statistically significantly lower than that of B group and C1 group(P<0.05)，while no statistically significant differences of relative quantity expression of P-ERK protein of hippocampus or prefrontal cortex was found between B group and C1 group(P>0.05).Conclusion Chronic stress stimulation can reduce the autonomous activity level of rats，fluoxetine hydrochloride can reduce the impact of chronic stress stimulation on autonomous activity level of rats to some extent，and ERK signal pathway activation of hippocampus and prefrontal cortex may correlated with stress adaptation in rats.

Stress，psychological；Extracellular signal-regulated kinases；Hippocampus；Prefrontal cortex；Rat

國家高技術研究發(fā)展計劃“863”計劃項目(2006AA02Z430)；國家自然科學基金重大計劃項目(91232719)；國家臨床重點?？?上海市精神衛(wèi)生中心(衛(wèi)生部醫(yī)政司2011-873)；上海市自然科學基金資助項目(09ZR1427200)；上海市衛(wèi)生局公共衛(wèi)生海外人才項目(GWHW201208)；上海交通大學科學基金項目(11XJ21006)

方貽儒，E-mail：yirufang@aliyun.com 彭代輝，E-mail：pdhsh@126.com

R 395

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.07.013

2017-04-15；

2017-07-11)

1.100092北京市，航天中心醫(yī)院

2.200030上海市精神衛(wèi)生中心