臧明鑫，李佳璇，謝雙羽，崔文，姜艷平，徐義剛，喬薪瑗，王麗，周晗，劉敏，李一經(jīng)，唐麗杰

東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

一株抗藍(lán)舌病病毒8型VP2蛋白單克隆抗體識別的線性抗原表位的鑒定

臧明鑫，李佳璇，謝雙羽，崔文，姜艷平，徐義剛，喬薪瑗，王麗，周晗，劉敏，李一經(jīng)，唐麗杰

東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

臧明鑫, 李佳璇, 謝雙羽, 等. 一株抗藍(lán)舌病病毒8型VP2蛋白單克隆抗體識別的線性抗原表位的鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2017,33(8): 1244–1252.

Zang MX, Li JX, Xie SY, et al. Identification of the epitope recognized by a monoclonal antibody against the VP2 protein of bluetongue virus serotype 8. Chin J Biotech, 2017, 33(8): 1244–1252.

為研究本實(shí)驗(yàn)室制備的一株抗藍(lán)舌病病毒8型 (BTV-8) VP2蛋白的單克隆抗體 (MAb) 3G11識別的B細(xì)胞抗原表位，利用噬菌體肽庫展示技術(shù)對3G11識別的抗原表位進(jìn)行篩選并鑒定。經(jīng)過4輪淘選后挑取藍(lán)斑測序，測序結(jié)果經(jīng)分析后獲得 KLLAT序列，與 BTV-8 VP2蛋白氨基酸序列比對后獲得共同的短肽序列為283LL284；合成4種短肽序列：KLLAA、KALAT、KLAAT和KLLAT，與3G11細(xì)胞上清和腹水分別進(jìn)行間接ELISA鑒定，結(jié)果表明，短肽KLLAA和KLLAT與3G11細(xì)胞上清及腹水具有較強(qiáng)的結(jié)合能力；與24種BTV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)結(jié)果表明，這兩種短肽都可與 BTV-8陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)；序列分析結(jié)果可見，該表位的氨基酸序列283LL284在不同來源的BTV-8毒株間保守，確定283LL284為MAb3G11識別抗原表位的關(guān)鍵氨基酸。本研究為建立8型BTV特異性的免疫學(xué)檢測方法和相關(guān)病毒蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

藍(lán)舌病病毒8型，VP2蛋白，單克隆抗體，抗原表位

藍(lán)舌病 (Bluetongue，BT) 是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV) 引起，經(jīng)庫蠓、伊蚊等媒介昆蟲進(jìn)行傳播的烈性非接觸性傳染病[1]。其主要感染山羊、綿羊、牛、駱駝等反芻類動(dòng)物[2]，感染動(dòng)物的平均病死率為30%，其中綿羊的病死率可高達(dá)80%。世界衛(wèi)生組織 (OIE) 規(guī)定其為必須呈報(bào)的動(dòng)物疫病，中國將其列為一類動(dòng)物傳染病[3]。該病具有地域性、季節(jié)性和周期性的特點(diǎn)，迄今為止已發(fā)現(xiàn) 27種血清型的BTV，各型之間無交叉保護(hù)[4-6]。我國已檢測出BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-12、BTV-15、BTV-16和 BTV-24共 10種血清型，其中 BTV-1和 BTV-16為我國主要的致病血清型[7-9]，但沒有我國檢測到BTV-8的報(bào)道。2006年8月，BTV-8在荷蘭首次流行，后在歐洲大規(guī)模流行，該病在全球的暴發(fā)有擴(kuò)大趨勢，且血清型種類多、變異快，為有效控制其流行，早期診斷就顯得尤為重要[10-12]。

BTV是迄今為止發(fā)現(xiàn)的分子量最大的RNA病毒[13]，其基因組由10個(gè)雙鏈RNA組成，這10個(gè)dsRNA包裹于雙層蛋白質(zhì)衣殼內(nèi)，共編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白 (VP1-7) 和 4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a和 NS4)[14]。外殼蛋白VP2由L2基因編碼，不同BTV血清型間VP2的氨基酸序列差異從 22.4%到 73%不等[15-17]。相同血清型的不同毒株間的VP2序列也存在較大差異，最大可達(dá)到30%，這表明VP2序列的變異與BTV血清型之間有密切聯(lián)系[18-20]。本研究中應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)試劑盒篩選本實(shí)驗(yàn)室制備的一株抗 BTV-8 VP2蛋白的單克隆抗體(MAb) 3G11所識別的B細(xì)胞表位，并合成4種短肽作為抗原通過間接ELISA方法與BTV-8型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)，對篩選出的抗原表位進(jìn)行鑒定，本研究為建立8型BTV特異性的免疫學(xué)檢測方法和相關(guān)病毒蛋白功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 單克隆抗體和血清

抗BTV-8 VP2蛋白MAb 3G11 (抗體亞類IgG2b) 細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；1–24型BTV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性血清購自藍(lán)舌病參考實(shí)驗(yàn)室The Pirbright Institute；MAb 3G11純化后腹水，效價(jià)為10–5(純化后腹水SDS-PAGE鑒定結(jié)果見圖1)。

1.2 主要試劑

Ph.D.-12TM13噬菌體肽庫試劑盒購自美國New England BioLabs (NEB) 公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自中杉金橋有限公司；TMB顯色液購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

圖1 純化后的腹水 SDS-PAGE鑒定 (M：蛋白marker；1：純化前腹水；2：純化后腹水)Fig. 1 Analysis of purified ascitesby SDS-PAGE. M:marker; 1: ascites; 2: purified ascites.

1.3 間接免疫熒光試驗(yàn)

將BHK21細(xì)胞傳至放置爬片的12孔板內(nèi)，待細(xì)胞長滿單層后接種8型BTV，同時(shí)設(shè)置對照孔。3%多聚甲醛固定液室溫固定30 min；每孔加入3%的BSA 37 ℃封閉1 h；以保存的細(xì)胞上清液為一抗，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對照組，37 ℃孵育1 h；用PBS洗滌3次，5 min/次；加入1︰2 000稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG，200 μL/孔，避光條件下37 ℃作用1 h；避光條件下用PBS洗滌3次，5 min/次；在倒置熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 夾心ELISA鑒定MAb3G11特異性

兔抗BTV血清包被的ELISA板，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h；用PBST洗3次，每次5 min；孔中加50 μL BTV-8型病毒，37 ℃ 1 h，洗板3次；1︰5 稀釋單抗上清，每孔 50 μL。37 ℃ 1 h，洗板3次；加1︰8 000稀釋羊抗鼠二抗 (HRP)，每孔50 μL，37 ℃ 1 h，洗板3次；經(jīng)TMB顯色15 min，再加入終止液，讀取OD450值。

1.5 抗原表位的篩選

參照 Ph.D.-12TM13噬菌體肽庫說明書，將MAb腹水作為抗原，加入到微孔板中，對噬菌體肽庫進(jìn)行 4次淘選，將第4次淘選后的產(chǎn)物測序；將測序結(jié)果進(jìn)行分析比對，獲得表位序列KLLAT，為了驗(yàn)證該短肽的準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)突變不同氨基酸的 4種短肽 KLLAA、KALAT、KLAAT和KLLAT，由武漢明皓生物科技股份有限公司合成。

1.6 利用間接ELISA鑒定短肽與MAb 3G11的反應(yīng)性

用包被稀釋液將 4種短肽 KLLAA、KALAT、KLAAT和KLLAT稀釋成不同的濃度，包被酶標(biāo)板，以MAb上清或純化腹水為抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為酶標(biāo)抗體，加入TMB顯色液，顯色10 min后加入終止液，鑒定短肽活性。

1.7 利用間接 ELISA鑒定短肽與標(biāo)準(zhǔn)血清的反應(yīng)性

將短肽KLLAT作為包被抗原，一抗為1–24型BTV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性血清，鑒定短肽與BTV陽性血清的反應(yīng)活性。

1.8 抗原表位的保守性分析

利用 NCBI數(shù)據(jù)庫中的 Blast軟件對 MAb 3G11識別的抗原表位序列283LL284進(jìn)行保守性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接免疫熒光鑒定結(jié)果

將 MAb 3G11細(xì)胞上清分別接種于 8型BTV感染的BHK21細(xì)胞和正常BHK21細(xì)胞，結(jié)果顯示，接種BTV-8的BHK21細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，對照細(xì)胞無熒光，表明MAb 3G11可以特異性識別8型BTV (圖2)。

2.2 夾心ELISA法檢測結(jié)果

夾心 ELISA檢測結(jié)果如圖 3所示，MAb 3G11能與 BTV-8發(fā)生陽性反應(yīng)，而與其他 23種病毒不發(fā)生陽性反應(yīng)。

2.3 抗原表位序列的篩選結(jié)果

將第4次篩選后的22個(gè)陽性克隆進(jìn)行DNA測序并對短肽氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果見表1，22個(gè)陽性克隆中共有18個(gè)展示的共同基因序列為KLLAT。

圖2 單克隆抗體與BTV8的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)Fig. 2 IFA assay of MAb reaction with BTV8 infected cells. (A) IFA result of 3G11. (B) Positive control. (C) IFA result of SP2/0 supernatant and BHK-21 cells infected with BTV8.

2.4 4種合成短肽與MAb 3G11的反應(yīng)性

用 4種合成短肽分別與單抗上清及腹水反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示，短肽KLLAT和KLLAA與單抗上清及腹水均可發(fā)生特異性的反應(yīng)，且S/N比值均大于2，表明該序列的短肽能與單抗上清和腹水中的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，而KALAT、KLAAT短肽與上清及腹水的反應(yīng)為弱陽性?？梢?83LL284為該表位序列的關(guān)鍵氨基酸。反應(yīng)中腹水反應(yīng)的值明顯高于上清，與腹水中非特異性結(jié)合較多有關(guān)。當(dāng)短肽包被量達(dá)到40 μg/mL時(shí)進(jìn)入平臺期，以其包被酶標(biāo)板，將腹水分別進(jìn)行 1×103、2×103、5×103、10×103、15×103、20×103、25×103、30×103倍的稀釋后作為一抗，當(dāng)稀釋比例達(dá)到20×103倍后進(jìn)入平臺期。

圖3 夾心ELISA鑒定MAb 3G11特異性Fig. 3 The specificity identification of MAb3G11 by AC-ELISA.

表1 噬菌體篩選序列測定結(jié)果Table 1 The sequencing results of phage display technology

2.5 短肽KLLAA和KLLAT與標(biāo)準(zhǔn)血清的反應(yīng)性

合成短肽KLLAA和KLLAT與不同血清型BTV陽性血清的間接 ELISA反應(yīng)結(jié)果基本一致，其中短肽KLLAA的反應(yīng)結(jié)果如圖5所示，可見短肽與 BTV-8、BTV-4、BTV-17、BTV-19標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的反應(yīng)呈較強(qiáng)陽性，短肽與BTV-1、BTV-3、BTV-7、BTV-10、BTV-12、BTV-13、BTV-15、BTV-20、BTV-21、BTV-23標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的反應(yīng)呈弱陽性。與BTV-8的反應(yīng)值明顯高于其他血清型 BTV。結(jié)果表明，283LL284序列為BTV-8的型異性抗原表位的關(guān)鍵氨基酸。與BTV-4、BTV-17、BTV-19有較強(qiáng)的陽性反應(yīng)可能是由于短肽與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中的非特異性抗體結(jié)合導(dǎo)致。

2.6 表位序列的保守性分析

將短肽序列283LL284與GenBank中的10個(gè)BTV-8不同毒株及3個(gè)BTV-7不同毒株進(jìn)行比對，結(jié)果如表2所示，13個(gè)毒株的第283和284位氨基酸處該序列高度保守；其他BTV1–24型VP2蛋白在該位置沒有這兩個(gè)氨基酸序列 (結(jié)果略)。

3 討論

目前研究抗原 B細(xì)胞表位的常用方法有噬菌體展示技術(shù)和肽掃描技術(shù)[21-22]。噬菌體展示技術(shù)具有方法簡便同時(shí)準(zhǔn)確性更高等優(yōu)點(diǎn)[23]，因此本研究中應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選 MAb 3G11識別的抗原表位。VP2蛋白為 BTV的型特異性抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，不同血清型之間VP2蛋白的氨基酸序列差異較大。制備針對不同清血型VP2蛋白的單克隆抗體并建立血清型鑒定方法，可對流行BTV的血清型進(jìn)行特異性檢測[24-25]。

圖4 4種短肽與MAb 3G11間接ELISA鑒定結(jié)果Fig. 4 Analysis of 4 short peptides reaction with the MAb3G11 by indirect ELISA. (A) Short peptide sequence KLLAT. (B) Short peptide sequence KLLAA. (C) Short peptide sequence KALAT. (D) Short peptide sequence KLAAT. (E) The concentration of ascites with different dilutions.

本研究以實(shí)驗(yàn)室制備的 BTV-8 VP2蛋白MAb 3G11經(jīng)夾心ELISA檢測能與BTV-8發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與 BTV1–24中其他 23個(gè)型病毒發(fā)生反應(yīng)。應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)試劑盒篩選3G11所識別的抗原表位，實(shí)驗(yàn)中共進(jìn)行了4輪淘選，其中第 3輪淘選的噬斑進(jìn)行測序，結(jié)果中有3個(gè)樣本為空樣本，在肽庫的結(jié)合區(qū)域沒有任何氨基酸，這種結(jié)果可能由噬菌體展示肽庫試劑盒有一定的局限性所導(dǎo)致。進(jìn)行第4輪淘選后挑取陽性克隆的測序結(jié)果得到了 KLLAT序列，該序列的3個(gè)氨基酸LL和T與BTV-8 VP2的氨基酸殘基283LLST286序列相符；席娜等[23]利用肽掃描技術(shù)鑒定 BTV-8 VP2的抗原表位為LCRLLSTIGRKMCNTE序列，該表位包含有283LL284序列，可見283LL284序列為BTV-8 VP2的抗原表位關(guān)鍵氨基酸；合成的短肽序列KLLAA、KALAT、KLAAT和KLLAT，與BTV-8標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行間接ELISA檢測，可見含有LL序列的短肽與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清結(jié)合能力較強(qiáng)，進(jìn)一步驗(yàn)證283LL284序列為MAb 3G11識別的線性抗原表位的關(guān)鍵氨基酸。利用短肽分別與24種血清型的BTV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行間接ELISA反應(yīng)，結(jié)果可見，該短肽序列與BTV-8標(biāo)準(zhǔn)陽性血清有較強(qiáng)的結(jié)合能力，但與其他幾種標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的反應(yīng)均呈陽性。這種結(jié)果可能由于合成短肽的序列過短，與其他標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中抗體的非特異性結(jié)合較多所引起的[26]。同時(shí)不同標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中抗體的濃度不同，進(jìn)一步優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的稀釋比例可以降低短肽與血清中抗體的非特異性結(jié)合。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室制備針對 BTV-8的MAb及鑒定其抗原表位為BT的型特異性診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)，為口岸檢疫中新血清型檢測方法的建立提供依據(jù)。

圖5 短肽KLLAA與不同血清型BTV陽性血清間接ELISA鑒定結(jié)果Fig. 5 Analysis of the short peptide KLLAA’s reaction with positive sera against different BTV serotypes in indirect ELISA.

表2 短肽KLLAA與不同的BTV-7和BTV-8毒株氨基酸序列BLAST分析結(jié)果Table 2 BLAST analysis of the motif KLLAA with the VP2 amino acid sequences of BTV-7 and BTV-8 strains

REFERENCES:

[1] Wei T, Xu QY, Geng HW, et al. Identification of the group-specific conformational epitopein VP7 of bluetongue virus. Chin J PrevVet Med, 2014, 36(1):63–66 (in Chinese).魏天, 徐青元, 耿宏偉, 等. 藍(lán)舌病病毒VP7蛋白競爭抑制群特異性構(gòu)象抗原表位的初步鑒定.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 36(1): 63–66.

[2] Tong L, Chai J, Zhang YF, et al. The gene product of the bluetongue virus and its biological function.China Anim Husb Vet Med, 2010, 37(7): 132–135(in Chinese).童亮, 柴俊, 張以芳, 等. 藍(lán)舌病病毒基因產(chǎn)物及其生物學(xué)功能. 中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37(7):132–135.

[3] Li N, Zhu JB, Xiao L, et al. Sequence analysis of bluetongue virus 1 M6 gene in Yunnan Province.China Anim Husb Vet Med, 2016, 43(2): 340–347(in Chinese).李楠, 朱建波, 肖雷, 等. 云南藍(lán)舌病病毒 1型毒株 M6基因序列分析. 中國畜牧獸醫(yī), 2016,43(2): 340–347.

[4] Maan S, Maan NS, Belaganahalli MN, et al.Full-genome sequencing as a basis for molecular epidemiology studies of bluetongue virus in India.PLoS ONE, 2015, 10(6): e0131257.

[5] Schulz C, Bréard E, Sailleau C, et al. Bluetongue virus serotype 27: detection and characterization of two novel variants in Corsica, France. J General Virol, 2016, 97(9): 2073–2083.

[6] Yang H, Lü MN, Sun MF, et al. Complete genome sequence of the first bluetongue virus serotype 7 isolate from China: evidence for entry of Africanlineage strains and reassortment between the introduced and native strains. Arch Virol, 2016,161(1): 223–227.

[7] Sun J, Sun EC, Liu EZ, et al. Preparation of monoclonal antibody against VP5 of serotype 3 bluetongue virus and identification of the antigenicepitope. Chin J PrevVet Med, 2014, 36(4):387–390 (in Chinese).孫晶, 孫恩成, 劉二戰(zhàn), 等. 藍(lán)舌病病毒 3型VP5蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位鑒定.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 36(4): 387–390.

[8] Zhang YX. Virus neutralization test, insect vector investigation, isolation, identification and preliminary study on pathogenicity of bluetongue virus in Guangxi[D]. Nanning: Guangxi University,2016 (in Chinese).張怡軒. 廣西BTV感染及傳播媒介調(diào)查、病毒分離鑒定與致病性初步研究[D]. 南寧: 廣西大學(xué),2016.

[9] Franco Mahecha OL, Ogas Castells ML,Combessies G, et al. Single dilution avidity-blocking ELISA as an alternative to the bovine viral diarrhea virus neutralization test. J Virol Methods, 2011, 175(2): 228–235.

[10] Zhang SN, Li HC, Zhu JB, et al. The epidemiological survey and serotype identification of bluetongue disease and the epizootic hemorrhage disease in Inner Mongolia in 2015. Chin J Prev Vet Med, 2016, 38(12): 939–943 (in Chinese).張勝男，李華春，朱建波，等. 2015年內(nèi)蒙古地區(qū)藍(lán)舌病及流行性出血熱流行病學(xué)調(diào)查及血清型鑒定. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2016, 38(12):939–943.

[11] Yang H, Xiao L, Wang J, et al. Phylogenetic characterization genome segment 2 of bluetongue virus strains belonging to serotypes 5, 7 and 24 isolated for the first time in china during 2012 to 2014. Transbound Emerg Dis, 2017, 64(4):1317–1321.

[12] Balam D, Daggupati S, Maddireddy H. Studies of the antigenic relationships between bluetongue virus serotypes 2, 9 & 15 isolated in Andhra Pradesh, India. Vet World, 2011, 4(10): 444–448.

[13] Maan S, Maan NS, Nomikou K, et al. Novel bluetongue virus serotype from Kuwait[J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(5): 886–889.

[14] Lin HL, Ran DL, Wang W. Research progress on bluetongue disease. Anim Husbandr Feed Sci,2008, (1): 4–7 (in Chinese).林漢亮, 冉多良, 王文. 藍(lán)舌病研究進(jìn)展. 新疆畜牧業(yè), 2008, (1): 4–7.

[15] Maan S, Maan NS, Batra K, et al. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assays for rapid identification of eastern and western strains of bluetongue virus in India. J Virol Methods, 2016, 234: 65–74.

[16] Ayhan A, Velipasaoglu M, Salman MC, et al.Preparation and characterization of a monoclonal antibody against the core protein VP7 of the 25th serotype of bluetongue virus. Monoclon Antibod Immunodiag Immunother, 2015, 34(2): 116–121.

[17] Maan NS, Maan S, Belaganahalli MN, et al.Identification and differentiation of the twenty six bluetongue virus serotypes by RT-PCR amplification of the serotype-specific genome segment 2. PLoS ONE, 2012, 7(2): e32601.

[18] Zientara S, Sailleau C, Viarouge C, et al. Novel bluetongue virus in Goats, Corsica, France, 2014.Emerg Infect Dis, 2014, 20(12): 2123–2125.

[19] Matsuo E, Roy P. Minimum requirements for bluetongue virusprimary replication in vivo. J Virol, 2013, 87: 882–889.

[20] Mellor PS, Carpenter S, Harrup L, et al. Bluetongue in Europe and the Mediterranean Basin: history of occurrence prior to 2006. Prev Vet Med, 2008,87(1/2): 4–20.

[21] Zhang ZD, Cheng J, Zhang SL. Principle of phage display technique and its application. World Chin J Digestol, 2003, 11(4): 459–461 (in Chinese).張忠東, 成軍, 張樹林. 噬菌體展示技術(shù)的原理及應(yīng)用. 世界華人消化雜志, 2003, 11(4): 459–461.

[22] Wang LF. Preparation of the monoclonal antibodies against VP2 protein of bluetongue virus serotype 17 and the VP2 B-cell epitopes identification[D].Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011 (in Chinese).王凌鳳. 藍(lán)舌病病毒17型VP2蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2011.

[23] Xi N. Preparation of the monoclonal antibodies against VP2 protein of bluetongue virus serotype 8 and identification of B-cell epitopes[D].Changchun: Jilin Agricultural University, 2014 (in Chinese).席娜. 藍(lán)舌病病毒 8型 VP2蛋白單克隆抗體的制備及 B細(xì)胞表位鑒定[D]. 長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[24] Zhang Q, Sun EC, Xu QY, et al. Preparation of monoclonal antibody against VP2 of bluetongue virus serotype 15 and identification of B-cellepitope. Chin J Prev Vet Med, 2015, 37(5):392–396 (in Chinese).張沁, 孫恩成, 徐青元, 等. 藍(lán)舌病病毒 15型VP2蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位鑒定.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2015, 37(5): 392–396.

[25] Geng HW, Qin YL, Li JP, et al. Development of monoclone competitive ELISA for detection of bluetongue virus antibodies. Chin J Prev Vet Med,2012, 34(5): 388–392 (in Chinese).耿宏偉, 秦永麗, 李俊平, 等. 藍(lán)舌病病毒重組VP7蛋白單克隆抗體制備及競爭ELISA檢測方法的建立. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, 34(5):388–392.

[26] Liu ST. Comparative study of four techniques for the detection ofbluetongue virus[D]. Yangzhou:Yangzhou University, 2010 (in Chinese).劉松婷. 藍(lán)舌病病毒四種檢測技術(shù)比較研究[D].揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2010.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Identification of epitope recognized by a monoclonal antibody against VP2 protein of bluetongue virus serotype 8

Mingxin Zang, Jiaxuan Li, Shuangyu Xie, Wen Cui, Yanping Jiang, Yigang Xu,Xinyuan Qiao, Li Wang, Han Zhou, Min Liu, Yijing Li, and Lijie Tang

College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China

To confirm the B cell epitope recognized by monoclonal antibody (MAb) 3G11 of bluetongue virus type 8(BTV-8) VP2 protein prepared in our laboratory, antigen epitopes recognized by 3G11 were screened and identified by phage display technology. KLLAT sequence was found by sequencing of blue spot after four rounds panning and283LL284of common short peptide sequence was obtained after comparison to amino acid sequence of BTV-8 VP2 protein. The peptide sequences KLLAA, KALAT, KLAAT and KLLAT were synthesized and identified by indirect ELISA. KLLAA and KLLAT bound strongly with supernatant and as cites of 3G11 cells and reacted specifically with BTV-8 positive standard sera. Further sequence analysis showed that amino acid sequence283LL284was conserved among different serotypes of BTV-8 strains, and283LL284was the key amino acids of antigen epitopes recognized by 3G11. This study laid the foundation to establish type 8 BTV specific immunological detection methods.

bluetongue virus serotype 8, VP2 protein, monoclonal antibody, antigen epitope

March 26, 2017; Accepted: July 28, 2017

Lijie Tang. Tel: +86-451-55190363; E-mail: tanglijie@163.com“十二五”國家科技支撐計(jì)劃 (No. 2013BAD12B01) 資助。

Supported by: National Key Technology R&D Program of China (No. 2013BAD12B01).