李英紅 劉珺珺 寧曉明 李 聰 李樂靜

AEG-1基因促進乳腺癌細胞株MCF-7轉移

李英紅1劉珺珺2寧曉明2李 聰3李樂靜1

目的 觀察AEG-1基因在細胞水平對乳腺癌細胞MCF-7轉移的影響。方法 通過將siRNA轉染進MCF-7細胞，沉默細胞中AEG-1表達量，以轉染陰性siRNA作為對照組。分別采用Transwell小室檢測細胞遷移侵襲能力、CCK8實驗檢測細胞增殖能力。同時通過檢測細胞中VEGF的變化及HUVEC細胞體外管腔形成實驗考察AEG-1對于血管新生的影響。結果 沉默AEG-1，MCF-7細胞的遷移能力、侵襲能力和增殖能力明顯受到抑制。沉默AEG-1，MCF-7細胞的VEGF表達明顯降低。上清處理HUVEC細胞，沉默AEG-1組的血管新生能力明顯受到抑制。結論 沉默AEG-1基因能顯著抑制MCF-7細胞轉移的多個層面，包括細胞遷移、侵襲、增殖以及血管新生。表明AEG-1基因在乳腺癌轉移過程中起著重要作用，也為將來乳腺癌治療開拓了新思路。

AEG-1；乳腺癌；轉移

乳腺癌是全世界女性常見的惡性腫瘤，也是導致女性癌癥死亡的重要原因之一[1-2]。目前臨床上主要采用手術、化療等治療手段。然而，乳腺癌的調控機制尚不明確。星型細胞上調基因1(Astrocyte elevated gene-1，AEG-1)是一種新型促癌基因，在多種惡性腫瘤中高表達，如結直腸癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌等[3-5]。AEG-1可能是乳腺癌形成和發(fā)展過程中的一個關鍵蛋白，選擇性抑制AEG-1在乳腺癌中的表達可能成為一種新的基因治療方法。癌癥轉移是一個復雜的多步驟的過程，主要包括腫瘤增殖、原位遷移和侵襲、穿透血管壁進入血液循環(huán)、再次穿透血管壁達到遠端組織、促進血管新生等多個步驟[6-8]。本文重點研究AEG-1參與調控乳腺癌的轉移過程，尤其是關于血管新生的作用，這項工作為我們對乳腺癌治療的研究提供了新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料

實時熒光定量PCR檢測試劑盒(北京全式金公司)，Trizol總RNA提取試劑(北京天根公司)，cDNA反轉錄試劑盒(大連寶生物公司)，膠回收試劑盒和質粒大提試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)。LipofectamineTM2000轉染試劑(Invitrogen公司，美國)。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，Transwell小室，孔徑8 μm(Costar公司，美國)，基質膠(BD公司，美國)。siRNA合成(吉瑪制藥技術有限公司)，DNA引物合成(蘇州金唯智生物科技有限公司)。MCF-7及HUVEC細胞購自上海中國科學院細胞庫。

1.2 siRNA合成

AEG-1的siRNA共合成3對，序列如下：1號(正義鏈：CCGAAGUACUCGUCAAAAATT，反義鏈：UUUUUGACGAGUACUUCGGCT)，2號(正義鏈：GAAUCUCCCAAACAAAUAATT，反義鏈：UUAUUUGUUUGGGAGAUUCCC)，3號(正義鏈：GGAUGUUAGCCGUAAUCAATT，反義鏈：UUGAUUACGGCUAACAUCCCA)，三條鏈等量混合在一起使用。RNAi陰性對照序列采用隨機序列：正義鏈：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，反義鏈：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。

1.2 細胞培養(yǎng)

MCF-7及HUVEC細胞購自上海中國科學院細胞庫。培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)基，含有10%的胎牛血清，100 U/mL的青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液一次。

1.3 細胞轉染

將MCF-7細胞接種于24孔板(105/孔)，24 h后采用LipofectamineTM2000試劑轉染，將脂質體和siRNA按照比例孵育后，加入到細胞培養(yǎng)板中，4～6 h后換液，待轉染24～48 h后取細胞進行后續(xù)的實驗。轉染陰性對照siRNA作為對照組NC，轉染AEG-1的siRNA作為實驗組siAEG-1，后續(xù)的表達量檢測實驗和功能研究實驗均按照如此分組。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

細胞中去除培養(yǎng)液后加入Trizol溶液直至裂解完全，氯仿抽提總RNA。總RNA反轉錄成cDNA后進行qPCR檢測。以GAPDH作為內參，qPCR條件為94℃變性2 min，94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)，每個樣品均做3組重復。

1.5 Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力實驗

取對數(shù)生長期的MCF-7細胞離心后重懸，取5×105個/mL細胞100 μL(不含血清)加入Transwell小室上層，600 μL全培養(yǎng)基加入小室下層，24 h后將小室取出，使用4%多聚甲醛溶液固定，使用棉棒輕輕擦除上層殘留細胞，下層細胞使用DAPI染色后置于倒置熒光顯微鏡下觀察。每個小室分別取上下左右中5個視野拍照記錄，統(tǒng)計5個視野中細胞總數(shù)。細胞侵襲實驗為先將Transwell小室預鋪基質膠，培養(yǎng)箱中預烘半個小時，然后將細胞離心后重懸，取5×105個/mL細胞100 μL(不含血清)加入Transwell小室上層，600 μL全培養(yǎng)基加入小室下層，48 h后將小室取出，使用4%多聚甲醛溶液固定，使用棉棒輕輕擦除上層殘留細胞，下層細胞使用DAPI染色后置于倒置熒光顯微鏡下觀察。每個小室分別取上下左右中5個視野拍照記錄，統(tǒng)計5個視野中細胞總數(shù)。

1.6 Western blot檢測蛋白表達

裂解細胞后提取細胞總蛋白，與緩沖液按比例混合后100℃煮5 min，8% SDS-PAGE上樣電泳后電轉至PVDF膜。PAGE電泳后電轉移至PVDF膜后，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗anti-AEG-1(Abcam)4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，后加入二抗37℃孵育45 min，TBST洗滌3次，在暗室中壓片，然后顯影、定影。

1.7 ELISA檢測MCF-7細胞上清液中VEGF含量

轉染siRNA后的細胞培養(yǎng)48 h后，收集細胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清液中VEGF含量。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 siRNA轉染對乳腺癌MCF-7細胞AEG-1基因表達水平的影響

通過qRT-PCR和Western blot法分別檢測AEG-1 siRNA轉染MCF-7細胞后AEG-1 mRNA和蛋白的相對表達水平。實驗組中轉染AEG-1 siRNA的AEG-1基因mRNA表達量相對于對照組下降了75%(P<0.01)(圖1A)。Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)轉染AEG-1 siRNA的實驗組與對照組相比，AEG-1的蛋白表達量也明顯減少(圖1B)，提示AEG-1基因被有效沉默。

圖1 AEG-1 siRNA在MCF-7細胞中沉默效率驗證Figure 1 AEG-1 siRNAs decreased the expression of AEG at levels of mRNA and protein in MCF-7 cells

2.2 沉默AEG-1基因對MCF-7細胞遷移、侵襲和增殖的影響

在MCF-7細胞中分別轉染AEG-1基因的siRNA和陰性對照siRNA(NC組)，利用Transwell方法檢測穿到下層的細胞數(shù)目，來評估細胞的遷移和侵襲能力的變化，穿到下層的細胞數(shù)目越多，則代表細胞遷移或侵襲能力越強。轉染AEG-1 siRNA之后，細胞遷移能力下降到18%(P<0.01)，而細胞侵襲能力下降到28%(P<0.01)(圖2)。通過CCK8法檢測AEG-1基因對MCF-7細胞增殖的影響，結果顯示：轉染AEG-1 siRNA 72 h之后，細胞增殖能力下降了30%(P<0.05)(圖3)。

圖2 沉默AEG-1抑制MCF-7細胞遷移和侵襲Figure 2 AEG-1 siRNAs inhibited the migration and invasion in MCF-7 cells

2.3 沉默AEG-1基因對VEGF基因在MCF-7細胞中的表達影響

通過qRT-PCR和Western blot法分別檢測AEG-1 siRNA轉染MCF-7細胞后VEGF基因mRNA和蛋白的相對表達水平。實驗組中轉染AEG-1 siRNA的VEGF基因mRNA表達量相對于對照組下降了50%(P<0.01)(圖4A)。Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)轉染AEG-1 siRNA的實驗組與對照組相比，VEGF的蛋白表達量也明顯減少(圖4B)。說明AEG-1基因被沉默后，影響了VEGF的表達。ELISA檢測結果也顯示轉染AEG-1 siRNA組細胞培養(yǎng)上清液中VEGF的含量與對照組相比降低了37%(P<0.05)(圖4C)。

2.4 沉默AEG-1基因對HUVEC細胞體外管腔形成的影響

使用MCF-7細胞培養(yǎng)上清處理HUVEC細胞，分為AEG-1 siRNA組和對照組。HUVEC細胞在Matrigel基底包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。結果表明AEG-1 siRNA組與陰性對照組相比，雖然均可見管腔形成，但是管腔形成明顯減少(圖5)。

圖3 沉默AEG-1抑制MCF-7細胞增殖Figure 3 AEG-1 siRNAs inhibited the proliferation in MCF-7 cells

圖4 沉默AEG-1抑制 VEGF的表達Figure 4 AEG-1 siRNAs inhibited the expression of VEGF protein in MCF-7 cells

圖5 沉默AEG-1抑制 HUVEC的管腔形成Figure 5 AEG-1 siRNAs inhibited the tube formation of HUVEC cells

3 討論

全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀70年代末開始一直呈上升趨勢。我國腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第1位。癌癥轉移是腫瘤患者致死的最主要原因之一。癌癥轉移是一個復雜的過程，有一個系統(tǒng)的基因網絡調控整個過程[9]。一些文章報道了幾個關鍵基因，例如KISS1、MMP9、VEGF等，為正向或者負向的調控因子[10-12]。但是我們對分子機制的理解遠遠不夠。在臨床上，我們仍然缺乏有效的控制癌癥轉移的方法。

AEG-1基因是一個重要的原癌基因，它起初發(fā)現(xiàn)在艾滋病和腫瘤壞死因子感染的人類腦星形膠質瘤當中[3]。人類AEG-1蛋白含有582個氨基酸，分子量為64 kD[3]。在許多腫瘤組織當中，其基因擴增要遠遠高于相鄰正常癌旁組織[3]。AEG-1基因的高表達導致了腫瘤的進展，也促進了許多腫瘤細胞的生長和侵襲[13-16]。近年來，有研究表明，AEG-1與著名的原癌基因C-Myc協(xié)同作用，促進癌癥的發(fā)生和腫瘤的生長[17]。因此我們猜測AEG-1在乳腺癌的發(fā)展和轉移過程中起到重要作用。我們的實驗結果發(fā)現(xiàn)，沉默乳腺癌細胞MCF-7的AEG-1表達量，可以有效地抑制細胞增殖、遷移和侵襲的能力。這些研究結果表明，AEG-1在乳腺癌的腫瘤生長、局部擴散、組織浸潤等過程中都發(fā)揮著重要作用。通過靶向沉默AEG-1，可以有效地抑制原發(fā)灶乳腺癌的生長和擴散。

血管生成是癌癥轉移和二級腫瘤組織形成的重要因素，因此很多治療癌癥的策略是基于抑制血管生成。VEGF是新血管形成的關鍵因子，已被證實是迄今最有效、特異性最高的血管生成因子，它可以促進內皮祖細胞的動員、遷移和分化并參與新血管形成[18-19]。在乳腺癌組織中，AEG-1顯著高表達[20]，并且與VEGF表達量呈相關性[21]。因此我們猜測AEG-1在乳腺癌中可能調控VEGF，并且在血管生成過程中起到重要作用。我們的實驗結果發(fā)現(xiàn)，沉默AEG-1可以有效地降低乳腺癌細胞MCF-7細胞VEGF的表達和分泌，并且可以抑制HUVEC的管腔形成。這些研究結果表明，在乳腺癌中AEG-1正向調控VEGF，通過靶向沉默AEG-1可以有效地抑制乳腺癌轉移過程中的血管新生。

綜上所述，AEG-1基因在乳腺癌轉移過程中起著重要作用，通過靶向抑制AEG-1的表達可以有效地抑制乳腺癌轉移。這一研究結果為將來乳腺癌治療開拓了新思路。

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(收稿：2017-02-24)

堅決貫徹執(zhí)行《發(fā)表學術論文“五不準”》通知

為弘揚科學精神，加強科學道德和學風建設，抵制學術不端行為，端正學風，維護風清氣正的良好學術生態(tài)環(huán)境，重申和明確科技工作者在發(fā)表學術論文過程中的科學道德行為規(guī)范，中國科協(xié)、教育部、科技部、衛(wèi)生計生委、中科院、工程院、自然科學基金會共同研究制定了《發(fā)表學術論文“五不準”》。

1．不準由“第三方”代寫論文?？萍脊ぷ髡邞约和瓿烧撐淖珜?，堅決抵制“第三方”提供論文代寫服務。

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本“五不準”中所述“第三方”指除作者和期刊以外的任何機構和個人；“論文代寫”指論文署名作者未親自完成論文撰寫而由他人代理的行為；“論文代投”指論文署名作者未親自完成提交論文、回應評審意見等全過程而由他人代理的行為。

本刊編輯部

AEG-1 promotes metastasis of breast cancer MCF-7 cells

LIYinghong1，LIUJunjun2，NINGXiaoming2，LICong3，LILejing1

1.Department of Internal Medicine，Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China；2.Department of Pathology，Harbin Medical University Cancer Hospital；3.Department of Hepatobiliary Surgery，China PLA General Hospital

Objective The objective of this study was to observe the effect of AEG-1 gene on the metastasis in breast cancer MCF-7 cells.Methods AEG-1 siRNAs were transfected into MCF-7 cells to silence AEG-1 expression，and negative siRNA was used as a control.Transwell chamber was used to detect the ability of cell migration and invasion of MCF-7 cells.CCK8 assay was used to detect the cell proliferation of MCF-7 cells.At the same time，the effect of VEGF on the angiogenesis was investigated by detecting the changes of lumen formation in HUVEC cells.Results The migration，invasive and proliferative abilities were significantly inhibited in MCF-7 cells transfected with AEG-1 siRNA.Knockdown AEG-1 was significantly decreased the level of VEGF in the supernatant of MCF-7 cells.Knockdown AEG-1 was also significantly inhibited the angiogenesis activity in HUVEC cells.Conclusion Knockdown AEG-1 can significantly inhibit the migration of MCF-7 cells，including cell migration，invasion，proliferation and angiogenesis.These results suggest that AEG-1 plays an important role in the metastasis process of breast cancer and opens up new ideas for future treatment breast cancer.

AEG-1；Breast cancer；Metastasis

黑龍江省教育廳課題面上項目(12521295)

1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院內五科(哈爾濱 150081)；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科；3.中國人民解放軍總醫(yī)院肝膽外科

李英紅，女，(1975-)，博士，副主任醫(yī)師，從事實體腫瘤基礎與臨床的研究。

李樂靜，E-mail：xcl_1974@163.com

R735.3+5

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.003