馬艷玲，李海賢，曾榮*

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山528231）

丁香酚對金黃色葡菌球菌抗菌作用的探究

馬艷玲，李海賢，曾榮*

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山528231）

為了尋找代替化學(xué)防腐劑的綠色安全天然添加劑，研究了丁香酚對金黃色葡萄球菌的抑菌作用。以丁香酚為原材料，采用96孔板微量稀釋法和瓊脂平板稀釋法確定最低抑菌濃度（M IC）和最低殺菌濃度（MBC），通過菌落數(shù)直觀地確定丁香酚對金黃色葡萄球菌的M IC值和MBC值；并以分光光度計法探究不同質(zhì)量濃度丁香酚對金黃色葡萄球菌中蘋果酸脫氫酶（MDH）和琥珀酸脫氫酶（SDH）酶活性的影響。結(jié)果表明，丁香酚對金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度（M IC）為600μg/m L，最低殺菌濃度（MBC）為700μg/m L，其可將金黃色葡萄球菌菌體蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度、蘋果酸脫氫酶（MDH）酶活、琥珀酸脫氫酶（SDH）酶活分別降至0.033mg/m L、8.28 U/mg、2.40U/m L，原因可能是抑制了菌體三羧酸循環(huán)和電子鏈傳遞中相關(guān)關(guān)鍵酶的活性。

丁香酚；金黃色葡萄球菌；抗菌作用；蘋果酸脫氫酶；琥珀酸脫氫酶

隨著食品安全話題不斷受到關(guān)注，人們對食品的質(zhì)量有了更高的要求，不但要求營養(yǎng)，還要求綠色健康。因長期使用化學(xué)防腐劑而導(dǎo)致致癌性、致突變性和致畸性等潛在安全問題時有發(fā)生[1]，同時會對自然界的生態(tài)環(huán)境造成不利的影響[2]。因此，尋找廣譜、高效、低毒、安全的食品防腐劑成為食品領(lǐng)域研究的熱點之一。

丁香是桃金娘科蒲桃屬植物，原產(chǎn)印尼，是我國進口“南藥”之一。其內(nèi)富含多種活性成分（丁香酚，β-石竹烯等），具有抗氧化、抑菌驅(qū)蟲和治療神經(jīng)痛等功效[3]。其中丁香酚（2-甲氧基-4-（2-丙烯基）苯酚）是丁香精油最主要的抗菌活性成分。國內(nèi)外有很多關(guān)于丁香以及丁香精油的研究：安同偉等[4]采用超臨界二氧化碳萃取法提取丁香酚，并通過抑菌試驗和動物試驗分別檢驗了丁香酚的抗菌功能和麻醉作用。曾榮等[5]以丁香精油及丁香酚為研究對象，發(fā)現(xiàn)丁香精油和丁香酚具有廣譜抗菌性，對供試的革蘭氏陰性和陽性菌均表現(xiàn)出了較強的抑菌活性，其中對革蘭氏陽性菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌。FEMANDO L等[6]發(fā)現(xiàn)丁香酚對嬰兒利什曼原蟲有影響。丁香酚作為植物精油的重要活性成分，在生物防腐抑菌方面具有一定的潛力。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚對于多種致病菌有抑制作用[7]。其中革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球適應(yīng)性強，是引起食品污染以及細菌性食物中毒的主要來源[8]。

細菌中的蘋果酸脫氫酶（malatedehydrogenase，MDH）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）在三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中起著重要作用，是三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈的關(guān)鍵酶，其活性大小直接影響到細菌的生長[9]。因此，本研究以金黃色葡萄球（Staphylococcusaureus）為供試菌，采用96孔板微量法和瓊脂平板稀釋法探究丁香酚對金葡菌的最低抑制濃度（m inimum inhibition concentration，M IC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），并研究丁香酚對細菌體內(nèi)的蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶酶活性的影響，為探究丁香酚抑菌作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁香酚（純度≥99%）：廣州和博生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923：廣東省微生物研究所菌種保藏中心；吐溫80：海麥克林生化科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂和MH肉湯：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基：生物工程上海有限公司；考馬斯亮藍：上海源聚生物科技有限公司；牛血清蛋白：寶泰克生物科技有限公司；蘋果酸脫氫酶試劑盒和琥珀酸脫氫酶試劑盒：南京建成生物工程研究所；氯化鈉、磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MulitisknalFC型酶標(biāo)儀、GENESYS10S紫外可見分光光度計：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 丁香酚對金黃色葡萄球菌的M IC測定

采用96孔板微量稀釋法和瓊脂平板稀釋法[10-11]。取96孔板，第一列為空白對照（CK），加入MH肉湯200μL，每列的第一個孔加入MH肉湯100μL，第2～10列第1～5個孔加入用肉湯稀釋丁香酚，含量分別為1.0mg/m L、0.9mg/m L、0.8mg/m L、0.7mg/m L、0.6mg/m L、0.5mg/m L、0.4mg/m L、0.3mg/m L、0.2mg/m L，每孔100μL，且加入100μL菌懸液，每個孔的菌濃度為5×105CFU/m L（即第2～10列第1個孔為丁香酚空白，第2～10列第2～5個孔為丁香酚樣品）。同時設(shè)置陽性對照（第11列第1～5個孔加入100μLMH肉湯以及100μL懸菌液）以及試劑實驗組（第12列第1～5個孔加入100μLMH肉湯以及100μL吐溫）。37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。以陽性對照中細菌生長呈渾濁和空白對照透明為前提，觀察其他孔內(nèi)渾濁情況。抑菌率的測定[11]：本試驗以輕微模糊或濁度明顯減少為判定終點。同時，在酶標(biāo)儀上讀取波長620nm處的吸光度值。抑菌率計算公式如下：

以抑菌率為90%的濃度為最低抑菌濃度（M IC），以抑菌率為99%的濃度為最低殺菌濃度（MBC）[11]。另外采用第二個方法瓊脂平板稀釋法來測試，用肉湯稀釋丁香酚，加入45m L的瓊脂中，使其含量分別為0.9mg/m L、0.8mg/m L、0.7mg/m L、0.6mg/m L、0.5mg/m L，再在每一個培養(yǎng)皿中加入10μL菌懸液，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，以平板未見菌落的最低丁香酚含量為M IC，實驗重復(fù)3次。

1.3.2 丁香酚對金黃色葡萄球菌的MBC測定

從96孔板微量稀釋法實驗中取濁度明顯減少的丁香酚樣品試液，接種至無菌瓊脂中，搖勻，37℃培養(yǎng)24 h，未見菌落生長的為MBC，實驗重復(fù)3次。

1.3.3 丁香酚對金黃色葡萄球菌體內(nèi)MDH和SDH酶活性的影響

將金黃色葡萄球菌接分別接入LB培養(yǎng)基和含M IC丁香酚的LB培養(yǎng)基，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，10 000 r/min離心培養(yǎng)液10m in收集菌體，并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH7.3）洗滌菌體3次，每組設(shè)置3個平行樣。加入與菌體等體積的2mg/m L的溶菌酶溶液，攪拌后置于37℃水浴鍋中，當(dāng)菌體開始發(fā)粘時取出，按照菌體：PBS緩沖液=1∶6（V/V）進行配比，10 000 r/min低溫離心10m in，取出上清液備用。按照考馬斯亮藍法測定蛋白含量，以小牛血清蛋白對照[12-13]。按照試劑盒說明書方法進行檢測。

MDH酶活測定：于波長340 nm處進行比色，雙蒸水調(diào)零后，加入50μL上清液，取已預(yù)溫好的1m L工作液迅速沖入0.5 cm的石英比色皿中，于20s時讀吸光度值OD1，反應(yīng)1min后讀取吸光度值OD2；空白對照取50μL雙蒸水，加入1m L工作液，其他操作與測定相同，于20 s時讀吸光度值A(chǔ)1，反應(yīng)1m in后讀取吸光度值A(chǔ)2。MDH酶活計算公式如下：

SDH酶活測定：于波長600 nm處進行比色，蒸餾水調(diào)零后，加入100μL上清液，取已預(yù)溫好的2.6m L工作液迅速沖入1 cm的比色皿中，于5 s時讀吸光度值OD1'，反應(yīng)1 m in后讀取吸光度值OD2'。SDH酶活計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚對金黃色葡萄球菌M IC和MBC結(jié)果

表1 不同質(zhì)量濃度丁香酚對金黃色葡萄球菌抑菌率的影響Table 1 Effects of different concentrations o f eugeno lon antibacterial rate of Staphylococcus aureus

由分光光度計法檢測OD值無顯著差異可知，試劑對照組和陽性對照組渾濁程度幾乎一致，即說明吐溫對照組的菌體生長狀態(tài)和陽性對照幾乎無差別，因此，可忽略丁香酚的溶劑（0.1%吐溫）對金黃色葡萄球菌的生長影響。由于菌液的OD值可以衡量菌液中細菌的數(shù)目[8]，因此OD值的變化可以反應(yīng)不同濃度的丁香酚對金黃色葡萄球菌的抑菌效果的差異。以O(shè)D值為基礎(chǔ)，用抑菌率來分析丁香酚對金黃色葡萄球菌的M IC和MBC。根據(jù)96孔微量稀釋法結(jié)果顯示（見表1），最低抑菌濃度為600μg/m L，最低殺菌濃度為700μg/m L。

采用瓊脂平板法測定M IC和MBC，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 不同質(zhì)量濃度丁香酚對金黃色葡萄球菌的抑菌情況Fig.1 Antibacterialeffectof different concentration of eugenolon Staphylococcus aureus

圖2 不同質(zhì)量濃度丁香酚對金黃色葡萄球菌的殺菌情況Fig.2 Sterilization effect of different concentration of eugenolon S.aureus

由圖1、圖2可知，與陽性對照相比，丁香酚對金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度為600μg/m L，最低殺菌濃度為700μg/m L。在探測不同濃度丁香酚對金葡菌的抑菌實驗和殺菌實驗中，可以直觀看出陽性對照的菌落數(shù)比用500μg/m L濃度處理的金葡菌的菌落數(shù)多，在600μg/m L質(zhì)量濃度處理的金葡菌，幾乎沒有菌落，丁香酚質(zhì)量濃度700～900μg/m L時，未見有菌落。且可以知道以未加丁香酚的陽性對照為參考，隨著作用于金葡菌的丁香酚濃度增大，細菌在平板的密集程度下降。因此，丁香酚對金葡菌抑制作用存在濃度依賴性。

2.2 丁香酚對金葡菌體內(nèi)蛋白質(zhì)濃度的影響

表2 丁香酚對金黃色葡萄球菌菌體蛋白質(zhì)濃度的影響Table 2 Effect of eugenolon protein contents of S.aureus

由表2可知，對照組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.27mg/m L，丁香酚組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.033mg/m L，較對照組降低了87.78%，丁香酚組和對照組的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度差異極顯著（P＜0.01）。丁香酚組與對照組相比，細菌蛋白質(zhì)濃度降低。

2.3 丁香酚對金葡菌體內(nèi)MDH酶活力的影響

表3 丁香酚對金黃色葡萄球菌MDH酶活的影響Tab le 3 Effect of eugenolon MDH activity of S.aureus

由表3可知，對照組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的MDH酶活力16.93U/mg，丁香酚組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的MDH酶活力為8.28 U/mg，較對照組降低了51.10%，丁香酚組和對照組的MDH酶活性差異極顯著（P＜0.01）。因此丁香酚組與對照組相比，細菌體內(nèi)MDH酶活性降低。

2.4 丁香酚對金葡菌體內(nèi)SDH酶活力影響

表4 丁香酚對金黃色葡萄球菌SDH酶活的影響Table 4 Effect of eugenolon SDH activity of S.aureus

由表4可知，對照組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的SDH酶活力為4.00U/m L，丁香酚組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的SDH酶活力為2.40U/m L，較對照組降低了40.00%，丁香酚組和對照組的SDH酶活性差異顯著。丁香酚組與對照組相比，細菌體內(nèi)SDH酶活性降低。

3 討論

在20世紀(jì)50年代，醫(yī)藥工作者已經(jīng)開始研究中藥抑菌的效果，發(fā)現(xiàn)很多中藥具有抑菌抗菌的作用。丁香酚具有廣譜抑菌效果，能抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、灰霉病菌等的生長[5，14-15]。由于丁香酚是天然提取物，具有很高的安全性，與化學(xué)防腐劑相比，有著安全無毒、綠色環(huán)保的優(yōu)點。因此，丁香酚在食品工業(yè)中得到廣泛的研究應(yīng)用[16-18]。但是對于研發(fā)食品防腐劑，不但是探究其抗菌效果，更重要的是了解其抑菌機制。抑菌劑主要的作用機理是：一是作用于細胞壁和生物膜系統(tǒng)，使細胞透性改變，從而使細胞代謝紊亂；二是作用于核酸等遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及表達受到了抑制；三是作用于細菌細胞內(nèi)的酶系統(tǒng)或功能蛋白，抑制代謝途徑。目前的食品防腐劑大多是通過抑制微生物的酶活性而起作用的。

結(jié)果表明，丁香酚有效抑制細菌的生長，且具有濃度依賴性。通過對酶活力和蛋白質(zhì)含量的試驗，預(yù)測其抑菌機理。首先從丁香酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)角度來分析，丁香酚是苯酚類，從分子結(jié)構(gòu)上看，丁香酚中含有酚羥基、醚鍵、碳碳雙鍵，具有酚醚和烯烴性質(zhì)。苯酚類的結(jié)構(gòu)，酚的羥基氧原子的未共用電子對與苯環(huán)的共軛作用，不但使苯酚成穩(wěn)定化合物，而且也有利于苯酚的離解，然后解離成苯氧負離子，該離子可能與酶中的活性部位形成化學(xué)鍵，進而導(dǎo)致代謝系統(tǒng)紊亂[2]。然后，從酶的角度分析可能存在的抑菌機理。酶是生物大分子，足跡布滿相當(dāng)大的生物膜系統(tǒng)。從丁香酚作用于金黃色葡萄球菌后，蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶酶活力降低，與對照組相比，有顯著的差異，特別是蘋果酸脫氫酶。蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶都是三羧酸循環(huán)的氧化還原酶，是細胞生長代謝和繁殖必需之物。蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶正常能否進行化學(xué)反應(yīng)，會直接影響到三羧酸循環(huán)的運行，影響到細胞代謝。因此，從酶活力的角度分析，可能的作用機理是丁香酚影響了這兩個酶的分子結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生了變化，從而改變了構(gòu)像，使酶活性降低。最后，從丁香酚對金葡菌蛋白濃度的影響結(jié)果表現(xiàn)，丁香酚能夠抑制部分蛋白質(zhì)的合成。從蛋白質(zhì)合成的角度來分析作用機理，可能的作用機理是丁香酚對蛋白質(zhì)作用于金黃色葡萄球菌后，因為起細胞透性的改變，使得與蛋白合成相關(guān)的核酸類物質(zhì)外泄，進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到抑制，并最終導(dǎo)致細胞死亡。

4 結(jié)論

丁香酚能抑制金黃色葡萄球菌生長，其最低抑制濃度為600μg/m L，最低殺菌濃度為700μg/m L，其可將金黃色葡萄球菌菌體蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度、蘋果酸脫氫酶（MDH）酶活、琥珀酸脫氫酶（SDH）酶活分別降至0.033mg/m L、8.28U/mg、2.40U/m L。其機理可能是抑制了菌體三羧酸循環(huán)和電子鏈傳遞中相關(guān)關(guān)鍵酶的活性，影響了菌體的正常生長。

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Investigation ofantibacterialeffectofeugenolon Staphylococcusaureus

MA Yanling,LIHaixian,ZENG Rong*
(SchoolofFood Science and Engineering,Foshan University,Foshan 528231,China)

In order to seek a green and natural chemical preservatives,the antibacterial effectof eugenol on Staphylococcus aureus was investigated. Using eugenolas raw material,them inimum inhibition concentration(M IC)and them inimum bactericidal concentration(MBC)were confirmed by plate dilution and brothm icrodilutionmethod.The effects of different concentrationsof eugenolonmalic dehydrogenase(MDH)and succinodehydrogenase(SDH)activity were investigated by spectrophotometer.The results showed that the M ICwas 600μg/m land the MBC was700μg/m l.In addition,the protein content,MDH activity and SDH activity of S.aureus could be declined to 0.033mg/m l,8.28 U/mg and 2.40 U/m lafter treated by eugenol.Themain reason forvarietieswas that thekey enzyme for the cell tricarboxylic acid cycleand electron chainwere inhibited by eugenol.

eugenol;Staphylococcusaureus;antibacterialeffect;malatedehydrogenase;succinic dehydrogenase

TS202.3

0254-5071（2017）08-0130-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.028

2017-05-31

廣東省自然科學(xué)基金項目（2015A030310301）

馬艷玲（1986-），女，講師，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。

*通訊作者：曾榮（1978-），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。