周新尚，逄飛，竇少華，3*，喬慧，遲乃玉

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622；3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遼寧大連116024）

海洋低溫淀粉酶菌株的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

周新尚1，2，逄飛1，2，竇少華1，2，3*，喬慧1，2，遲乃玉1，2

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622；3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遼寧大連116024）

以大連黃海海泥和海水為樣品，采用稀釋涂布平板透明圈法初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，得到一株淀粉酶高產(chǎn)菌ZXS-5，測得酶活為6.25U/m L。通過形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA序列鑒定，菌株ZXS-5為熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens）。該酶的最適作用溫度為25℃，酶的熱穩(wěn)定性相對較差；最適作用pH值為8.0，屬于堿性酶，該酶在酸性條件下穩(wěn)定性較差；Ba2+、Cu2+、乙二胺四乙酸（EDTA）對該酶抑制性較強(qiáng)，F(xiàn)e2+、Zn2+、Mn2+對該酶的活性影響不明顯，Mg2+、Na+對該酶激活作用較弱，Ca2+對該酶激活作用較強(qiáng)。

低溫淀粉酶；鑒定；熒光假單胞菌；酶學(xué)性質(zhì)

淀粉酶是能催化淀粉水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖等一系列低聚糖酶類的總稱[1]。淀粉酶可從淀粉分子內(nèi)部催化α-1,4糖苷鍵及α-1,6糖苷鍵水解。根據(jù)作用方式不同歸類為α-淀粉酶和β-淀粉酶，水解產(chǎn)物為小分子單糖和高分子極限糊精等[2-4]。

淀粉酶是目前研究最多，應(yīng)用范圍最廣的工業(yè)酶制劑之一，尤其在淀粉深加工、食品、燃料酒精、紡織品脫膠等行業(yè)起著要重要作用[4]。但目前市場所用淀粉酶多為中溫酶或高溫酶，在低溫環(huán)境（0～20℃）下酶活性較差，限制了其在洗滌、食品等對低溫要求苛刻行業(yè)上的進(jìn)一步應(yīng)用。而低溫淀粉酶的最適反應(yīng)溫度≤40℃且對熱敏感，相比中溫或高溫酶潛在的應(yīng)用價(jià)值更高，因此，自20世紀(jì)70年代以來，對低溫淀粉酶資源的開發(fā)成為功能酶研究的新熱點(diǎn)[5-7]。

本研究以于大連黃海的海水和海泥為樣品，初篩得到10株低溫淀粉酶產(chǎn)生菌，復(fù)篩過程中菌株ZXS-5的酶活最高，進(jìn)而對菌株ZXS-5進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，并對菌株ZXS-5所產(chǎn)低溫淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。以期為海洋低溫淀粉酶資源的開發(fā)利用提供一定的工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：大連黃海海水和海泥；蛋白胨、葡萄糖、磷酸氫二鉀、可溶性淀粉、牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸鎂、瓊脂粉：生物工程（上海）股份有限公司；核酸Marker：大連寶生物有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

富集培養(yǎng)基：可溶性淀粉30 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂16 g/L，pH 7.0。0.1MPa滅菌30m in。

初篩培養(yǎng)基：可溶性淀粉30 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂16 g/L，pH 7.0。0.1MPa滅菌30m in。

復(fù)篩培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨6 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl1 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 7.0，0.1MPa滅菌30min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl5 g/L，pH 7.4。0.1MPa滅菌30min。

斜面保藏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂16 g/L，pH 7.4，0.1MPa滅菌30m in。

發(fā)酵培養(yǎng)基：同復(fù)篩培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250全溫振蕩培養(yǎng)箱：常州萬科儀器科技有限公司；M IR-254低溫恒溫培養(yǎng)箱：上海創(chuàng)奕科教設(shè)備有限公司；HH-6數(shù)顯控恒溫水浴鍋：深圳市鼎鑫宜實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-914A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海和呈儀器制造有限公司；UV-5100B紫外可見分光光度計(jì)：上海重逢科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊醫(yī)療器械廠；GRX-02A干熱滅菌箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；API-9700型基因擴(kuò)增儀：美國ABI有限公司；DYCP-32B型核酸電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制備方法

復(fù)篩得到的菌株接種于裝液量為200m L/500m L發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量4%，20℃、150 r/m in培養(yǎng)36 h。發(fā)酵液于4℃、8 000 r/m in離心15min，上清液即為粗酶液。

1.3.2 淀粉酶酶活測定方法

淀粉酶酶活測定參照OKOLO BN等[8]方法。反應(yīng)體系如下：25m L具塞比色管中加入2.0m L 2%的可溶性淀粉糊化液、2m L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 6.4），25℃預(yù)熱5min，加入1.0m L粗酶液，25℃、160 r/m in振蕩反應(yīng)5m in，加入終止反應(yīng)試劑3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）2m L，移液搶吹打混勻，煮沸5m in。取出后流水冷卻，加去離子水定容至20m L?？瞻讓φ眨簩?.0m L酶液替換為1.0m L醋酸-醋酸鈉緩沖液（其余條件同上），在波長525 nm條件下比色測定吸光度值[9]。淀粉酶酶活單位定義：在分析條件下，1m in釋放1μmol的還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位，酶活力單位為U/m L。還原糖以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用二硝基水楊酸（DNS）法進(jìn)行測定[10]。

1.3.3 菌株篩選

（1）菌種初篩：大連黃海海水和海泥各15份，海泥取2.0 g，海水10m L加入裝有50m L無菌生理鹽水的三角瓶中，劇烈振蕩5min，靜置30min取上清液2m L接種于富集培養(yǎng)基中，在20℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，取2m L菌液接種于相同的富集培養(yǎng)基中再次定向富集3 d。采用平板劃線法，將富集培養(yǎng)后的菌液梯度稀釋，涂布在平板篩選培養(yǎng)基上。20℃培養(yǎng)2～5d，以菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈（盧戈氏碘液染色法）為初篩標(biāo)準(zhǔn)，挑取帶有透明圈的單菌落進(jìn)一步平板劃線純化，保藏初篩菌株，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[11]。

（2）菌種復(fù)篩：將初篩菌株接種于100m L/250m L發(fā)酵培養(yǎng)基中，20℃、150 r/min培養(yǎng)36h，以發(fā)酵液中低溫淀粉酶的酶活作為復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)篩得到產(chǎn)低溫淀粉酶酶活最高的菌株[12]。

1.3.4 菌落形態(tài)特征

在初篩培養(yǎng)基上觀察菌落的形狀、大小、顏色等形態(tài)學(xué)特征，通過革蘭氏染色在光學(xué)顯微鏡（10×100）下觀察菌體形態(tài)。

1.3.5 鑒定菌株生理生化特征

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（第8版）[13]細(xì)菌鑒定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，主要包括葡萄糖氧化發(fā)酵測定、氧化酶反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、產(chǎn)生吲哚試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、糖、醇類發(fā)酵試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生、含碳化合物的利用、檸檬酸鹽的利用等。

1.3.6 菌株分子生物學(xué)鑒定

采用TIANGEN柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株DNA。以提取到的ZXS-5菌株DNA為模板，16S rDNA擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。其引物如下：正向引物P1（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和反向引物P2（5'-AA GTCGTAACAAGGTAACC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳，同時(shí)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生工生物有限公司測序，將測序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)基本局部比對搜索工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）序列比對，利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

1.3.7 酶學(xué)性質(zhì)研究

（1）酶的最適作用溫度：將粗酶液分別置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃條件下，按照低溫淀粉酶的酶活力測定方法測定酶活，以同組最高酶活為100%計(jì)算相對酶活，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)。

（2）酶的熱穩(wěn)定性：將粗酶液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴中持續(xù)保溫60min，并分別在10m in、20min、30m in、40min、50min和60m in測定低溫淀粉酶剩余酶活力，以同組最高酶活為100%計(jì)算相對酶活，每次進(jìn)行3組平行試驗(yàn)。

（3）酶的最適作用pH：在酶最適作用溫度條件下，酶活測定體系中把醋酸-醋酸鈉緩沖液換為pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的磷酸鹽緩沖液測定低溫淀粉酶酶活，以同組最高酶活為100%計(jì)算相對酶活，每次進(jìn)行3組平行試驗(yàn)。

（4）酶的pH穩(wěn)定性：分別將低溫淀粉酶粗酶液至于pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0磷酸鹽緩沖液中，25℃保育60m in，測定低溫淀粉酶酶活，以同組最高酶活為100%計(jì)算相對酶活，每次進(jìn)行3組平行試驗(yàn)。

（5）化學(xué)試劑對酶活影響：在酶最適作用條件下，酶液中分別加入去離子水、CaCl2、NaCl、MgSO4、FeCl、CuSO4、ZnSO4、MnCl2、及乙二胺四乙酸（ethylenediam ine tetraacetic acid，EDTA）等化學(xué)試劑，各反應(yīng)體系中金屬離子的終濃度為10mmol/L，測定低溫淀粉酶酶活，以添加去離子水為對照組計(jì)算相對酶活，每次進(jìn)行3組平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)過初篩，得到10株（菌株ZXS-1～ZXS-10）能夠產(chǎn)生透明圈的菌株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩測定其低溫淀粉酶淀粉酶活力，結(jié)果如表1所示，菌株ZXS-5的低溫淀粉酶活力最高，其最高酶活為6.25U/m L。與國內(nèi)一些研究報(bào)道相比，菌株ZXS-5所產(chǎn)低溫淀粉酶酶活較高，可用于工業(yè)生產(chǎn)。

表1 菌株產(chǎn)低溫淀粉酶酶活比較Tab le 1 Com parison of low-tem perature am ylase activity produced by strains

2.2 菌株ZXS-5的菌落及形態(tài)特征

菌株ZXS-5的菌落及細(xì)胞形態(tài)特征見圖1。由圖1A可知，菌株ZXS-5的菌落呈黃色、圓形、不生孢、不透明、邊緣整齊，表面光滑濕潤。由圖1B可知，菌株ZXS-5的顯微形態(tài)呈桿狀，為革蘭氏陰性菌。

圖1 菌株ZXS-5菌落形態(tài)(A)及顯微形態(tài)(B)Fig.1 Co lonialm orphology(A)and m icroscopic m orphology(B)of strain ZXS-5

2.3菌株生理生化特性

表2 菌株ZXS-5生理生化特征Tab le 2 Physiologicaland biochem ica lcharacteristics of strain ZXS-5

由表2可知，菌株ZXS-5生理生化特征為：淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、尿素水解試驗(yàn)、精氨酸雙水解、過氧化氫酶試驗(yàn)、反硝化試驗(yàn)、果聚糖形成試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，油脂水解試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、從甘油產(chǎn)生二羥基丙酮試驗(yàn)、氨基酸脫羧酶反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。由生理生化試驗(yàn)結(jié)果可初步鑒定其為假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）。

2.4 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株ZXS-5的16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，獲得一條清晰的條帶，根據(jù)Maker定量分析菌株ZXS-5的16SrDNA序列大小為1498bp。

圖2 菌株ZXS-5 16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 PCR am plification electrophoretogram of 16S rDNA of strain ZXS-5

將菌株ZXS-5的16S rDNA序列輸入美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中Nucleotide BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中同源性最高的己知分類菌株序列進(jìn)行比較，用軟件MEGA5以鄰接（neighbor-joining，NJ）法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建如圖3所示。由圖3可知，菌株ZXS-5與熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescensstrain（NR 114476.1）同源性最高為99%，因此可以鑒定菌株ZXS-5為熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens）。

圖3 菌株ZXS-5 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain ZXS-5 based on 16S rDNA sequence

2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 低溫淀粉酶的最適反應(yīng)溫度

由圖4可知，低溫淀粉酶的最適酶促反應(yīng)溫度為25℃，而酶在40℃以后活力迅速下降，但是低溫淀粉酶在10℃仍有一定的酶活力，低溫淀粉酶的這種特性符合低溫酶的標(biāo)準(zhǔn)[15]。這對于需要加熱的淀粉工業(yè)來說，低溫酶減少了能量消耗、降低了生產(chǎn)成本具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

圖4 低溫淀粉酶的最適作用溫度曲線Fig.4 The optimum tem perature curve o f low-temperature amylase

2.5.2 低溫淀粉酶的熱穩(wěn)定性

圖5 低溫淀粉酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Therm alstability of low-temperature am ylase

由圖5可知，低溫淀粉酶在20～40℃之間酶活保持較高，酶的活性相對穩(wěn)定熱；從50℃開始，酶活急劇下降；60℃處理1 h，酶活基本為0。所以低溫淀粉酶在相對寬泛的溫度環(huán)境下，熱穩(wěn)定性較差，這也表明低溫淀粉酶在某些特殊生產(chǎn)工藝中有重要的應(yīng)用價(jià)值[16]。

2.5.3 低溫淀粉酶的最適作用pH

圖6 pH對低溫淀粉酶酶活的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of low-temperature am ylase

由圖6可知，該酶在pH4.0～7.0時(shí)酶活迅速下降，在pH 8.0時(shí)酶活最高，在pH 8.0～10.0時(shí)酶活略有下降，說明該低溫淀粉酶的最適酶促反應(yīng)pH值為8.0，該酶屬于堿性酶。此外該堿性淀粉酶在洗滌行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。2.5.4低溫淀粉酶的pH穩(wěn)定性

圖7 低溫淀粉酶pH穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of low-tem perature am ylase

由圖7可知，該酶經(jīng)pH 8.0的緩沖液作用60m in，酶活力基本保持不變，所以該酶的最適pH為8.0。當(dāng)pH＞8.0時(shí)，該酶酶活力呈下降趨勢。該酶在pH8.0～9.0保持80%的相對酶活，在pH 10.0時(shí)也保持50%以上的相對酶活。但是在pH 5.0～6.0的緩沖液作用下酶活迅速下降，說明該酶是堿性酶，在酸性條件下酶的穩(wěn)定性較差，所以應(yīng)該在堿性條件下利用該酶。

2.5.5 化學(xué)試劑對酶活影響

表3 金屬離子與EDTA對低溫淀粉酶活的影響Table 3 Effects ofm etal ions and EDTA on the activity of low-tem perature am ylase

由表3可知，Ba2+、Cu2+、乙二胺四乙酸（ethylenediam ine tetraacetic acid，EDTA）對該酶抑制性較強(qiáng)，F(xiàn)e2+、Zn2+、Mn2+對該酶的活性影響不明顯，Mg2+、Na+對該酶激活作用較弱，Ca2+對該酶激活作用較強(qiáng)。由此可見該酶屬于金屬酶類[17]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從大連黃海海泥與海水中共篩選出10株產(chǎn)低溫淀粉酶的菌株，其中ZXS-5具有最高的低溫淀粉酶活力，為6.25U/m L。菌株ZXS-5所形成的菌落呈黃色、圓形、不生孢、不透明、邊緣整齊，表面光滑濕潤。經(jīng)過顯微觀察該菌株菌體呈桿狀，為革蘭氏陰性菌。該菌經(jīng)生理生化、16S rRNA鑒定，結(jié)果鑒定菌株ZXS-5為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。菌株ZXS-5與其他國內(nèi)外篩選的產(chǎn)淀粉酶的菌株相比[18]，具有適應(yīng)低溫環(huán)境（20℃），耐鹽性極好，耐高壓等優(yōu)良特征。對菌株ZXS-5所產(chǎn)的低溫淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)初步研究表明，該酶的最適作用溫度為25℃，作用溫度較低，屬于低溫酶類，最適作用pH值為8.0，屬于堿性淀粉酶；該酶活性對Ca2+的依賴明顯，Na+、Mg2+對該酶具有一定的促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+、Zn2+、Mn2+對該酶的活性影響不明顯，而Ba2+、 Cu2+及EDTA較明顯的抑制該酶的活性，由此可見該酶屬于金屬酶類。

本研究篩選和探究了低溫微生物和低溫酶的一些特性，為低溫淀粉酶的開發(fā)和利用做了初步的研究，該酶的分離純化及工業(yè)發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。

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Isolation,identification and enzymatic property ofa low-temperatureamylase-producing strain from marine

ZHOU Xinshang1,2,PANG Fei1,2,DOU Shaohua1,2,3*,QIAO Hui1,2,CHINaiyu1,2
(1.SchoolofLife Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China; 2.Liaoning Technology ofMarine M icrobiological Engineering Research Center,Dalian 116622,China; 3.SchoolofLife Science and Biotechnology,Dalian University ofTechnology,Dalian 116024,China)

Using seamud and seawater from Dalian Yellow Sea as samples,a higher amylase-producing strain ZXS-5 was obtained by spread plate method preliminary screening and shake flask fermentation secondary screening,and the enzyme activity was 6.25 U/m l.Through morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence identification,strain ZXS-5 was identified as Pseudomonas fluorescens.The optimum temperature of theamylasewas25℃and its thermostability was relatively poor.The optimum pH of the amylasewas8.0,and itwasalkaline amylase,and the pH stability wasweak in acidic condition.The amylase activity was strongly inhibited by Ba2+,Cu2+and ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA).The effects of Fe2+,Zn2+and Mn2+on the amylase activity were not obvious.The amylase activity was slightly activated by Mg2+and Na+,strongly activated by Ca2+.

low-temperatureamylase;identification;Pseudomonasfluorescens;enzymatic property

Q93-331

0254-5071（2017）08-0057-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.013

2017-05-21

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”項(xiàng)目（No.2014AA093512）；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2014020134）

周新尚（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锕こ碳懊腹こ獭?/p>

*通訊作者：竇少華（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锕こ碳懊腹こ獭?/p>