閔鐘熳，賈笑雨，解鐵民，周宇朦，鞏明娟，許雪，肖志剛*

（沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110034）

微生物發(fā)酵法提取米糠粕中可溶性膳食纖維的研究

閔鐘熳，賈笑雨，解鐵民，周宇朦，鞏明娟，許雪，肖志剛*

（沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110034）

以米糠粕為原料，枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）B4為發(fā)酵菌種，探討不同條件下微生物發(fā)酵法對(duì)米糠粕可溶性膳食纖維（SDF）得率的影響。選擇時(shí)間、溫度、接菌量、pH值進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行3因素3水平中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)。結(jié)果表明，發(fā)酵法提取可溶性膳食纖維最佳條件為發(fā)酵時(shí)間22.4 h、發(fā)酵溫度35.0℃、接種量6.6%。在此最佳條件下，SDF得率為12.88%，比優(yōu)化前提高了8.88%，微生物發(fā)酵法是一種較好的提取可溶性膳食纖維的方法。

米糠粕；可溶性膳食纖維；發(fā)酵；響應(yīng)面分析

膳食纖維（dietary fiber，DF）通常是指能抗人體小腸的消化吸收而能在大腸被部分或全部發(fā)酵的可食用植物性成分（纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等）、碳水化合物及其類似物的總稱[1]。其可延緩胃排空時(shí)間、控制體質(zhì)量和減肥，還有降血糖和血膽固醇，預(yù)防結(jié)腸癌、通便等作用，故營(yíng)養(yǎng)學(xué)家建議攝入適量的膳食纖維[2]。不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）在人體內(nèi)主要起機(jī)械蠕動(dòng)作用，而可溶性膳食纖維（soluble dieary fibre，SDF）具有較多的生理功能，起到防膽結(jié)石、排除有害金屬離子、抗糖尿病、降低血脂及膽固醇、防高血壓等作用[3]。

目前，膳食纖維的提取方法主要有化學(xué)法、酶法、膜分離法、發(fā)酵法等，其中微生物發(fā)酵法提取膳食纖維有很好的效果[4]。微生物發(fā)酵法是提取可溶性膳食纖維的新型技術(shù)手段，資源得到了合理利用，實(shí)現(xiàn)了微生物產(chǎn)酶與酶解過(guò)程的統(tǒng)一，節(jié)省了酶制劑在生產(chǎn)過(guò)程中的分離純化工藝，大大降低了生產(chǎn)成本。微生物發(fā)酵法不僅提高了可溶性膳食纖維得率，而且為生產(chǎn)高活性膳食纖維提供了有效的途徑[5]。

本試驗(yàn)以米糠粕為原料，利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B4，采用單因素結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化法[6]，研究了微生物發(fā)酵法提取米糠粕膳食纖維的工藝參數(shù)，旨在提高粕米糠中SDF含量，為SDF的開(kāi)發(fā)利用提供更多的理論依據(jù)[7]。對(duì)米糠粕資源的利用及可持續(xù)發(fā)展具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）B4：實(shí)驗(yàn)室自主分離；米糠粕：市售；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、MgSO4、NaCl、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2SO4：上海金穗生物科技有限公司；α-淀粉酶（4×104U/g）、蛋白酶（2×102U/mg）、淀粉葡萄糖苷酶（1×105U/g）：北京格林博遠(yuǎn)生物科技有限公司；種子培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基[9]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：取5 g米糠粕粉碎，加入50m L水，121℃滅菌15m in。

1.2 儀器與設(shè)備

SLI-700型恒溫培養(yǎng)箱、MSL-3780型高壓滅菌鍋：松下電器（中國(guó)）有限公司上海分公司；HZP-250型全溫培養(yǎng)振蕩器、DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；JSE11E22型離心機(jī)：貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司；HH-6型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠粕處理方法

米糠粕烘干后，粉碎過(guò)100目篩，密封儲(chǔ)存于陰涼干燥處備用。

1.3.2 菌種的活化

從斜面培養(yǎng)基挑取菌株B4，接種于10m L牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，封好試管放入恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)12 h。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取米糠粕原料5 g，裝入含50m L/250m L水的三角瓶中，分別考察發(fā)酵時(shí)間、溫度、接種量、pH值對(duì)SDF得率的影響，各取3次試驗(yàn)平均值。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)SDF得率的影響：設(shè)定發(fā)酵溫度為37℃、接種量為4%，分別選取4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h為不同的發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定SDF得率。

發(fā)酵溫度對(duì)SDF得率的影響：設(shè)定發(fā)酵時(shí)間為24 h、接種量為4%，分別選取30℃、32℃、34℃、36℃、38℃為不同的發(fā)酵溫度進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定SDF得率。

接種量對(duì)SDF得率的影響：設(shè)定發(fā)酵時(shí)間為24 h、溫度為36℃，分別選取2%、4%、6%、8%、10%為不同的接種量進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定SDF得率。

pH值對(duì)SDF得率的影響：設(shè)定發(fā)酵時(shí)間為24 h、溫度為36℃、接種量6%，分別取5、6、7、8、9不同pH值的發(fā)酵液進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定SDF得率。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以SDF得率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design Expert8.0軟件設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)[10]，考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量及各因素間交互作用對(duì)米糠粕SDF得率的影響。

1.3.5 SDF含量測(cè)定

表1 米糠粕SDF發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optim ization of SDF in rice bran meal

按照GB 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測(cè)定》[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)SDF得率的影響

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)SDF得率的影響Fig.1 Effects of different ferm entation time on SDF yie ld

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，SDF得率呈先增加后減少的趨勢(shì)，在24 h處達(dá)到最大值10.9%。令博等[12]對(duì)微生物發(fā)酵法提取葡萄皮渣膳食纖維的工藝優(yōu)化及其理化特性研究中也得出相同趨勢(shì)。SDF得率下降的原因可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的增加菌體將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，無(wú)法繼續(xù)提供微生物所需養(yǎng)分；隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，培養(yǎng)物中會(huì)累積大量有害物質(zhì)，影響了SDF得率。因此選擇發(fā)酵時(shí)間為24 h。

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)SDF得率的影響

圖2 不同發(fā)酵溫度對(duì)SDF得率的影響Fig.2 Effects of different fermentation tem perature on SDF yield

由圖2可知，SDF得率隨著發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。在發(fā)酵溫度36℃時(shí)SDF得率達(dá)到最大值11.2%。SDF得率下降的原因可能是36℃是菌體最適的作用溫度，高于或低于此溫度都不利于菌體的生長(zhǎng)，影響其自身代謝，從而影響對(duì)米糠粕的作用效果。因此選擇發(fā)酵溫度為36℃。

2.3 接種量對(duì)SDF得率的影響

由圖3可知，SDF得率隨著接種量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。在接種量6%時(shí)SDF得率達(dá)到最大值11.8%。SDF得率下降的原因可能是在低接種量時(shí)，不能提供足夠的活菌使米糠粕完全發(fā)酵，隨著接種量的增加，活菌數(shù)量增大，SDF得率也逐漸提高；當(dāng)接種量繼續(xù)增加時(shí)，菌體數(shù)量過(guò)多，消化分解速度加快，造成菌株?duì)I養(yǎng)不足和溶氧不足。因此選擇接種量為6%。

圖3 不同接種量對(duì)SDF得率的影響Fig.3 Effects of different inoculum on SDF yield

2.4 pH值對(duì)SDF得率的影響

圖4 不同pH值對(duì)SDF得率的影響Fig.4 Effects of different pH value on SDF yield

由圖4可知，SDF得率隨著pH的升高呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。在pH值為7時(shí)SDF得率達(dá)到最大值11.9%。SDF得率下降的原因可能與菌體作用的最適pH有關(guān)。當(dāng)偏離最適作用pH時(shí)，不利于菌體生長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)緩慢甚至死亡，從而影響其對(duì)米糠粕的作用效果，使SDF得率下降。在pH 6～8時(shí)對(duì)SDF的得率無(wú)明顯影響，從環(huán)保和產(chǎn)出率角度考慮，pH不作為響應(yīng)面優(yōu)化因素。因此選擇pH值為7。

2.5 發(fā)酵條件響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，不同試驗(yàn)因素對(duì)米糠粕SDF得率的影響有所不同[13]?？梢钥闯?個(gè)因素（發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量）對(duì)SDF得率（Y）的影響，為了優(yōu)化提取SDF最佳條件，以中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理為依據(jù)，并且根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析，設(shè)計(jì)17次試驗(yàn)，12次為析因試驗(yàn)，5次中心試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 米糠粕SDF發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for ferm entation conditions optim ization of SDF in rice bran meal

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到響應(yīng)面回歸方程如下：Y=11.38-0.50A-0.55B+0.58C+0.85AB-0.40AC-0.75BC-1.17A2-1.52B2-1.81C2

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of response equation

由表3可知，根據(jù)F值可知各個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響次序?yàn)镃＞B＞A，即接種量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間。建立的模型P=0.000 4＜0.01，模型顯著。失擬項(xiàng)P=0.9566＞0.05，表示純誤差不顯著。表明試驗(yàn)誤差均是由隨機(jī)誤差造成的，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的不利因素較小。其中二次項(xiàng)A2、B2、C2呈極顯著，一次項(xiàng)A、B、C和交互項(xiàng)AB、BC呈顯著。說(shuō)明相關(guān)因素對(duì)SDF得率影響較大。決定系數(shù)R2=0.961 6。表明微生物發(fā)酵法提高米糠粕中SDF得率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合度較好。校正決定系數(shù)R2=0.912 2，表明了該模型中各因素對(duì)SDF得率變化情況。綜上所述此模型有效，可以來(lái)預(yù)測(cè)分析各因素對(duì)米糠粕SDF得率的影響。

2.6 各因素之間的相互作用

圖5 發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度與接種量交互作用對(duì)SDF得率影響的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line o f effects of interaction between fermentation tim e,temperature and inoculum on SDF yield

由圖5可知，接種量較發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度曲線陡峭。當(dāng)接種量一定時(shí)，發(fā)酵溫度較發(fā)酵時(shí)間曲線陡峭，再次驗(yàn)證發(fā)酵溫度對(duì)SDF得率影響較發(fā)酵時(shí)間大，同時(shí)由等高線圖可知，其中A（發(fā)酵時(shí)間）、B（發(fā)酵溫度）兩因素等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，因此交互作用最為顯著，這與方差分析表中的結(jié)果相符合。經(jīng)過(guò)響應(yīng)面條件優(yōu)化，得到結(jié)果為發(fā)酵時(shí)間22.43 h，發(fā)酵溫度35.28℃，接種量6.55%，此條件下SDF得率為11.66%。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮到實(shí)際情況，為方便操作，修改發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間22.4 h，發(fā)酵溫度35.0℃，接種量6.6%，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，取3次試驗(yàn)平均值。得到的SDF平均得率為12.88%。與理論值相差1.22%，模型有效，試驗(yàn)數(shù)據(jù)與實(shí)際情況相符合。

3 結(jié)論

近年來(lái)，膳食纖維的研究一直是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，新的研究方法和技術(shù)被應(yīng)用于可溶性膳食纖維的研究中，膳食纖維更多的生理活性和加工特性也正在被發(fā)掘[14]。米糠粕是一種極好的質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的膳食纖維資源，利用B.subtilis B4發(fā)酵米糠粕，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化SDF得率[15]，確定最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵時(shí)間22.4 h，發(fā)酵溫度35.0℃，接種量6.6%。在此優(yōu)化條件下，SDF得率為12.88%，較優(yōu)化前提高了8.88%。

本試驗(yàn)中采用B.subtilis B4發(fā)酵米糠粕，使可溶性膳食纖維得率顯著提高，表明微生物發(fā)酵法是一種高效可行的改性膳食纖維的方法，為獲得高品質(zhì)膳食纖維提供了理論依據(jù)，因此具有十分廣闊的應(yīng)用前景[16]。

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Extraction of soluble dietary fiber in ricebranmealbym icrobial fermentationmethod

M IN Zhongman,JIA Xiaoyu,XIETiem in,ZHOU Yumeng,GONGM ingjuan,XU Xue,XIAO Zhigang*
(College ofGrain Science and Technology,Shenyang NormalUniversity,Shenyang 110034,China)

Using rice branmealasmaterial,Bacillussubtilis B4 as fermentation strains,the effectsofm icrobial fermentationmethodsunder different conditions on soluble dietary fiber(SDF)yield of rice branmealwere discussed.Using time,temperature,inoculum and pH as evaluation factors, single factorexperimentswere carried out.On thebasisof single factorexperiments,the fermentation extraction conditionswereoptimized by central composite design experiments of three factors and three levels.The results shown that the optimum extraction conditions of SDF by fermentation method were fermentation time22.4 h,temperature35.0℃and inoculum 6.6%.Under the conditions,the SDF yield was12.88%,which was8.88% higher than thatofbeforeoptim ization.M icrobial fermentationmethodwasagoodmethod for SDFextraction.

ricebranmeal;soluble dietary fiber;fermentation;response surface analysis

TS201.3

0254-5071（2017）08-0053-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.012

2017-05-31

沈陽(yáng)師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201610166300189）；遼寧省農(nóng)業(yè)青年科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2015053）；國(guó)家星火計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2015GA650007）；沈陽(yáng)師范大學(xué)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃

閔鐘熳（1982-），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

*通訊作者：肖志剛（1972-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食油脂及植物蛋白工程。