管晨峰，李玉珍，張開禮，李宗陽，黃國棟#（.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院藥學(xué)部，廣東深圳 58000；.深圳大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東深圳 58035）

組蛋白去乙酰化酶抑制劑RGFP109逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞對替莫唑胺耐藥性的機(jī)制研究

管晨峰1＊，李玉珍1，張開禮1，李宗陽2，黃國棟2#（1.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院藥學(xué)部，廣東深圳 518000；2.深圳大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東深圳 518035）

目的：研究組蛋白去乙?；敢种苿㏑GFP109逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的耐藥性機(jī)制。方法：建立對替莫唑胺（TMZ）耐藥的TR/U251細(xì)胞，試驗分為正常對照組、TMZ組（40 μmol/L）和TMZ（40 μmol/L）+RGFP109（0～120 μmol/L）不同濃度組，加入相應(yīng)藥物作用24 h后，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。TUNEL法和Annexin V/PI法檢測正常對照組、TMZ組和TMZ+RGFP109（42 μmol/L）組細(xì)胞的凋亡情況，免疫印跡法檢測3組細(xì)胞中O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）、存活蛋白（Survivin）、B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、B淋巴細(xì)胞瘤xL（Bcl-xL）蛋白表達(dá)，凝膠遷移實驗檢測3組細(xì)胞中p65乙?；郊捌渑cκB-DNA的結(jié)合能力。結(jié)果：與正常對照組和TMZ組比較，TMZ+RGFP109不同濃度組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性。當(dāng)RGFP109濃度為42 μmol/L時，TMZ對TR/U251細(xì)胞的敏感性與U251細(xì)胞相同。與正常對照組比較，TMZ組細(xì)胞中MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.01），p65乙?；綗o明顯變化，但p65與κB-DNA的結(jié)合能力增強(qiáng)（P＜0.01）。與TMZ組比較，TMZ+RGFP109組細(xì)胞中MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達(dá)均減弱（P＜0.01），p65乙?；皆鰪?qiáng)（P＜0.01），p65與κB-DNA的結(jié)合能力減弱（P＜0.01）。結(jié)論：RGFP109可通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子κB調(diào)節(jié)的抗凋亡蛋白表達(dá)，減弱p65與κB-DNA的結(jié)合來逆轉(zhuǎn)U251細(xì)胞對TMZ耐藥。

組蛋白去乙?；敢种苿㏑GFP109；轉(zhuǎn)錄因子κB；替莫唑胺；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞；乙?；?/p>

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）惡性腫瘤。烷化劑替莫唑胺（TMZ）是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤化療的主要藥物，但其耐藥性很大程度上減弱了其化療效果。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）的絲氨酸磷酸化水平在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中較高，其可導(dǎo)致各種細(xì)胞因子和原癌蛋白的表達(dá)失調(diào)[1]。因此，抑制NF-κB的活化可能成為解決膠質(zhì)母細(xì)胞瘤耐藥性問題的重要途徑。

研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙酰化酶（HAT）和去乙?；福℉DAC）在NF-κB翻譯后修飾過程中發(fā)揮著重要的作用[2]。以組蛋白乙酰化和去乙?；福℉DAC1和HDAC3）去乙?；癁榇淼目赡嫘赃M(jìn)程，影響著p65與κB-DNA的相互作用，從而調(diào)節(jié)NF-κB的轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，進(jìn)而可能對克服膠質(zhì)母細(xì)胞瘤耐藥性產(chǎn)生重要影響。RGFP109是二苯胺庚二酸類HDAC1和HDAC3的選擇性抑制劑，具有良好的血腦屏障透過率，其針對帕金森病治療的應(yīng)用研究已進(jìn)入臨床研究階段，具有良好的應(yīng)用前景。本文以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞為研究對象，研究RGFP109逆轉(zhuǎn)U251細(xì)胞的耐藥性的機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

CKX41倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；后置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；Multiskan go 1510酶標(biāo)儀（美國賽默飛公司）；TDL-5013臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)化學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

TMZ膠囊（美國Merck Sharp&Dohme公司，批號：H20080313，規(guī)格：每粒20 mg）；RGFP109原料藥（美國Selleck公司，批號：S729201，純度：99.17%）；高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）/碘化丙啶（PI）檢測試劑盒（美國Invitrogen公司）；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）、存活蛋白（Survivin）；B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、B淋巴細(xì)胞瘤xL（Bcl-xL）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；NF-κB p65和乙?；嚢彼釟埢髥慰寺】贵w（美國Abcam公司）；LightShift化學(xué)發(fā)光凝膠遷移實驗（EMSA）試劑盒（美國Pierce Biotechnology公司）。

1.3 細(xì)胞

人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞株購自中國科學(xué)院生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將U251細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中（添加鏈霉素、青霉素各100 u/mL），在含5%CO2、飽和濕度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每隔3 d以0.25%胰酶消化、傳代，并取部分對數(shù)生長期細(xì)胞懸浮于含10%二甲基亞砜（DMSO）、20%FBS、70%DMEM的細(xì)胞凍存液中，置于液氮保存。

2.2 耐藥菌株的建立

采用前期研究[1]中已建立的穩(wěn)定耐TMZ的U251細(xì)胞（TR/U251細(xì)胞）進(jìn)行試驗，已測得TMZ對TR/U251細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（283.45±22.38）μmol/L，對親本U251細(xì)胞的IC50為（39.88±6.25）μmol/L。

2.3 分組與給藥

以TMZ對親本U251細(xì)胞的IC50為TMZ聯(lián)合用藥濃度。將TR/U251細(xì)胞分為正常對照組、TMZ組（40 μmol/L）和TMZ（40 μmol/L）+RGFP109（20、40、60、80、100、120 μmol/L）不同濃度組，通過細(xì)胞活性檢測細(xì)胞存活率，篩選實現(xiàn)TMZ耐藥性逆轉(zhuǎn)的RGFP109聯(lián)合用藥濃度。再將試驗進(jìn)一步分為正常對照組、TMZ組、TMZ（40 μmol/L）+RGFP109（篩選所得濃度）組。

2.4 細(xì)胞活性測定

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，每孔含2 500個細(xì)胞，37℃下培養(yǎng)24 h，按“2.3”項下分組加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基100 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔，作用24 h。棄原培養(yǎng)液，每孔添加含10%CCK-8的培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)37℃下培養(yǎng)2 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度（OD），計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝給藥組OD值/正常對照組OD值×100%。試驗重復(fù)2次。

2.5 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期細(xì)胞種植于細(xì)胞爬片（7.5×105mL－1）上培養(yǎng)24 h，按“2.3”項下分組給藥，作用24 h，按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行染色，用后置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況（共計200個細(xì)胞）。

2.6 AnnexinⅤ/PI法檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期細(xì)胞種植于6孔板（7.5×105mL－1）中培養(yǎng)24 h，按“2.3”項下分組給藥，作用24 h，按照AnnexinⅤ/PI檢測試劑盒說明書進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.7 免疫印跡法檢測細(xì)胞中NF-κB通路相關(guān)因子的蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期細(xì)胞種植于6孔板（7.5×105mL－1）中培養(yǎng)24 h，按“2.3”項下分組給藥，作用24 h，分別加入細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，提取蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，確定蛋白電泳上樣體積。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜（PVDF），5%脫脂奶粉室溫封閉，洗膜，加入一抗（1∶500）溶液中4℃孵育過夜，加入二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，漂洗。滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）液后，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，用Quantity One軟件統(tǒng)計各抗體條帶灰度值。以MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示對應(yīng)蛋白的相對表達(dá)量。

2.8 EMSA檢測細(xì)胞中p65與κB-DNA的結(jié)合能力

取對數(shù)生長期的細(xì)胞種植于6孔板（7.5×105mL－1）中培養(yǎng)24 h，按“2.3”項下分組給藥，作用12 h，提取細(xì)胞核蛋白，然后按照EMSA試劑盒說明書操作，采用生物發(fā)光法進(jìn)行顯色，檢測p65與κB-DNA的結(jié)合能力。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 RGFP109濃度的篩選結(jié)果

與正常對照組（細(xì)胞存活率為100%）和TMZ組比較，TMZ+RGFP109（20～120 μmol/L）不同濃度組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01），并呈濃度依賴性。當(dāng)RGFP109濃度為42 μmol/L時，TMZ對TR/U251細(xì)胞的敏感性與親本U251細(xì)胞相同，因此選擇42 μmol/L作為TMZ+RGFP109組中RGFP109的濃度。TMZ+RGFP109組和TMZ組細(xì)胞存活率的測定結(jié)果見圖1。

圖1 TMZ+RGFP109組和TMZ組細(xì)胞存活率的測定結(jié)果Fig 1 Determination results of cell survival rate in TMZ+RGFP109 group and TMZ group

3.2 細(xì)胞凋亡情況

與正常對照組和TMZ組比較，TMZ+RGFP109組細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯增加，證實RGFP109逆轉(zhuǎn)了TR/U251細(xì)胞的耐藥性，增強(qiáng)了TMZ的細(xì)胞毒性作用。各組細(xì)胞凋亡情況的熒光圖見圖2，流式圖見圖3。

圖2 各組細(xì)胞凋亡情況的熒光圖Fig 2 Fluorescence diagram of cell apoptosis in each group

圖3 各組細(xì)胞凋亡情況的流式圖Fig 3 Flow cytometry of cell apoptosis in each group

3.3 細(xì)胞中NF-κB通路相關(guān)因子的蛋白表達(dá)

與正常對照組比較，TMZ組TR/U251細(xì)胞中MGMT、Survivin、Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。與TMZ組比較，TMZ+RGFP109組TR/U251細(xì)胞中MGMT、Survivin、Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。各組細(xì)胞中MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達(dá)的電泳圖見圖4，測定結(jié)果見圖5。

圖4 各組細(xì)胞中MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 4 Electrophoresis chart of MGMT，Survivin，Bcl-2，Bcl-xL protein expressions in cells in each group

3.4 細(xì)胞中p65與κB-DNA的結(jié)合情況

與正常對照組和TMZ組比較，TMZ+RGFP109組細(xì)胞中乙酰化的賴氨酸殘基增加，p65乙?；斤@著增強(qiáng)（P＜0.01），而p65-κ B-DNA表達(dá)明顯減弱（P＜0.01）。由此證明RGFP109導(dǎo)致了p65乙酰化增強(qiáng)，減弱了p65與其κB-DNA結(jié)合的能力，阻斷了NF-κB通路的活化。各組細(xì)胞中p65乙?；郊捌渑cκB-DNA結(jié)合的電泳圖見圖6，測定結(jié)果見圖7。

4 討論

有研究顯示，NF-κB和相關(guān)腫瘤抑制基因的異?；罨艽龠M(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞抵抗TMZ[2-4]。本研究結(jié)果也證明了RGFP109通過抑制NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后修飾克服了細(xì)胞對TMZ的抵抗性[5]。作為經(jīng)典核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB的活化進(jìn)程歷經(jīng)眾多的翻譯后修飾[6-7]，其中乙?；荖F-κB反式激活的關(guān)鍵步驟[8-9]。因此，筆者集中探討了RGFP109介導(dǎo)NF-κB通路的調(diào)節(jié)機(jī)制。

圖5 各組細(xì)胞中MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達(dá)的測定結(jié)果Fig 5 Determination results of MGMT，Survivin，Bcl-2，Bcl-xL protein expressions in cells in each group

圖6 各組細(xì)胞中p65乙?；郊捌渑cκB-DNA結(jié)合的電泳圖Fig 6 Electrophoresis chart of the p65 acetylation level and its binding with κB-DNA in cells in each group

圖7 各組細(xì)胞中p65乙酰化水平及其與κB-DNA結(jié)合的測定結(jié)果Fig 7 Determination results of the p65 acetylation level and its binding with κB-DNA in cells in each group

筆者曾在預(yù)試驗中建立了多種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，并初步觀察到RGFP109能減弱細(xì)胞株對TMZ的耐藥性以及增強(qiáng)TMZ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。在本研究中，筆者使用TMZ和RGFP109共處理TR/U251細(xì)胞的方法來評估作用效果，并最終闡明了RGFP109減弱TR/U251細(xì)胞對TMZ的耐藥性以及增強(qiáng)TMZ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的機(jī)制。在本研究中，筆者還發(fā)現(xiàn)NF-κB誘導(dǎo)上調(diào)的抗凋亡蛋白可能與TMZ抵抗性的增強(qiáng)有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)RGFP109能顯著降低TR/U251細(xì)胞中NF-κB調(diào)節(jié)的抗凋亡蛋白MGMT、Survivin、Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)。進(jìn)一步的免疫共沉淀結(jié)果分析表明，與正常對照組和TMZ組比較，TMZ+RGFP109組細(xì)胞乙酰化的賴氨酸殘基的增加，顯著增強(qiáng)了p65乙?；?。

此外，通過進(jìn)一步的EMSA，證明了p65的乙酰化降低了其結(jié)合κB-DNA的能力，是導(dǎo)致NF-κB通路的活化受阻的重要原因。這也證明了RGFP109導(dǎo)致的p65乙?；鰪?qiáng)，減弱了p65與其κB-DNA結(jié)合的能力，阻斷了NF-κB通路的活化，進(jìn)而抑制κB-靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致TR/U251細(xì)胞中NF-κB調(diào)節(jié)的抗凋亡蛋白MGMT、Survivin、Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)水平降低，逆轉(zhuǎn)了對TMZ的化療抵抗作用。此外，RGFP109良好的血腦屏障透過作用、較強(qiáng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織代謝分布作用，以及對細(xì)胞組織的低毒性，都預(yù)示著RGFP109在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤化療抵抗的逆轉(zhuǎn)過程中有著良好的臨床治療價值。

[1] Li ZY，Zhang C，Zhang Y，et al.A novel HDAC6 inhibitor tubastatin A：controls HDAC6-p97/VCP-mediated ubiquitination-autophagy turnover and reverses temozolomide-induced ER stress-tolerance in GBM cells[J].Cancer Lett，2017，doi：10.1016/j.canlet.2017.01.025.

[2] Bredel M，Bredel C，Juric D，et al.Tumor necrosis factoralpha-induced protein 3 as a putative regulator of nuclear factor-kappaB-mediated resistance to O6-alkylating agents in human glioblastomas[J].J Clin Oncol，2006，24（2）：274-287.

[3] Greene WC，Chen LF.Regulation of NF-kappaB action by reversible acetylation[J].Novartis Found Symp，2004，doi：10.1002/0470862637.

[4] Vermeulen L，De Wilde G，Van Damme P，et al.Transcriptional activation of the NF-kappaB p65 subunit by mitogen-and stress-activated protein kinase-1（MSK1）[J].EMBO，2003，22（6）：1313-1324.

[5] Perkins ND，Gilmore TD.Good cop，bad cop：the different faces of NF-kappaB[J].Cell Death Differ，2006，13（5）：759-772.

[6]Malvaez M，McQuown SC，Rogge GA，et al.HDAC3-selective inhibitor enhances extinction of cocaine-seeking behavior in a persistent manner[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（7）：2647-2652.

[7] Johnston TH，Huot P，Damude S，et al.RGFP109，a histone deacetylase inhibitor attenuates L-DOPA-induced dyskinesia in the MPTP-lesioned marmoset：a proof-ofconcept study[J].Parkinsonism Relat Disord，2013，19（2）：260-264.

[8] Liu E，Wu J，Cao W，et al.Curcumin induces G2/M cell cycle arrest in a p53-dependent manner and upregulates ING4 expression in human glioma[J].J Neurooncol，2007，85（3）：263-270.

[9] Perkins ND.Post-translational modifications regulating the activity and function of the nuclear factor kappa B pathway[J].Oncogene，2006，25（51）：6717-6730.

Study on the Mechanism of Histone Deacetylase Inhibitor RGFP109 in Reversing Resistance of Glioma U251 Cells to Temozolomide

GUAN Chenfeng1，LI Yuzhen1，ZHANG Kaili1，LI Zongyang2，HUANG Guodong2（1.Dept.of Pharmacy，the Eighth Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University，Guangdong Shenzhen 518000，China；2.Dept.of Neurosurgery，the First Hospital Affiliated to Shenzhen University，Guangdong Shenzhen 518035，China）

OBJECTIVE：To study the mechanism of histone deacetylase inhibitor RGFP109 in reversing resistance of glioma U251 cells.METHODS：TR/U251 cells resistance to temozolomide（TMZ）was extrablished.The test was divided into normal control group，TMZ group（40 μmol/L）and TMZ（40 μmol/L）+RGFP109（0-120 μmol/L）different concentrations groups.After 24 h of adding into related medicines，CCK-8 was used to detect the cell survival rate and calculate the half inhibitory concentration（IC50）.TUNEL and Annexin V/PI were used to detect the cell apoptosis in normal control group，TMZ group and TMZ+RGFP109（42 μmol/L）group.Immunoblotting was used to detect the O6-methyl guanine-DNA methyltransferase（MGMT），Survivin，B lymphoma 2（Bcl-2），B lymphoma xL（Bcl-xL）protein expression；and gel migration test was used to detect the p65 acetylation level and its binding capacity with κB-DNA.RESULTS：Compared with normal control group，cell survival rate in TMZ+RGFP109 different concentrations groups was obviously decreased（P＜0.05），showing a concentration-dependent manner.When the RGFP109 concentration was 42 μmol/L，the sensitivity of TMZ to TR/U251 cells was the same with U251 cells.Compared with normal control group，MGMT，Survivin，Bcl-2，Bcl-xL protein expressions in cells of TMZ groups were enhanced（P＜0.01）；p65 acetylation level had no obvious changes，while the binding capacity of p65 and κB-DNA was strengthened（P＜0.01）.Compared with TMZ group，MGMT，Survivin，Bcl-2，Bcl-xL protein expressions in cells of TMZ groups were weakened（P＜0.01）；p65 acetylation level was enhanced（P＜0.01）；and the binding capacity of p65 and κB-DNA was weakened（P＜0.01）.CONCLUSIONS：RGFP109 can reverse the resistance of U251 cells to TMZ by down-regulating the anti-apoptotic protein expressions adjusted by transcription factor κB（NF-κB）and weakening the binding of p65 and κB-DNA.

Histone deacetylase inhibitor RGFP109；Transcription factor κB；Temozolomide；Glioma U251 cells；Acetylation

R361+.3

A

1001-0408（2017）22-3091-05

2017-02-17

2017-06-01）（編輯：鄒麗娟）

＊主管藥師。研究方向：神經(jīng)腫瘤、臨床藥理學(xué)。電話：0755-83982222-30876。E-mail：guancf1117@sina.com

#通信作者：主任醫(yī)師，教授，博士。研究方向：神經(jīng)內(nèi)鏡、腦腫瘤基礎(chǔ)和臨床。電話：0755-83366388-3118。E-mail：jxgd211@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.18