劉燕琳，劉海燕，常 金，黨和勤（1.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，山東泰安 71000；.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東泰安 71000）

桑黃多糖對肉瘤S180細胞體內(nèi)外的抑瘤作用Δ

劉燕琳1＊，劉海燕2，常 金2，黨和勤1#（1.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，山東泰安 271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東泰安 271000）

目的：研究桑黃多糖對肉瘤S180細胞體內(nèi)外的抑瘤作用。方法：選用對數(shù)生長期肉瘤S180細胞，加入0（空白對照）、2、4、8 mg/mL的桑黃多糖溶液，分別培養(yǎng)12、24、36、48 h，MTT法測定細胞體外增殖抑制率，熒光染色法觀察細胞凋亡形態(tài)，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。建立S180細胞荷瘤小鼠模型并隨機分為對照組和桑黃多糖高、中、低劑量組（400、200、100 mg/kg），每組10只，每天ig相應(yīng)藥物1次，連續(xù)12 d；末次給藥24 h后處死小鼠，稱瘤質(zhì)量，計算抑瘤率，免疫組化法檢測腫瘤組織中抑癌基因PTEN與癌基因C-myc蛋白表達。結(jié)果：與空白對照比較，桑黃多糖能增高S180細胞的增殖抑制率，促進其凋亡率升高（P＜0.05或P＜0.01），且具有濃度與時間依賴性。與對照組比較，桑黃多糖各劑量組小鼠的抑瘤率明顯升高（P＜0.01），PTEN蛋白表達增強（P＜0.05或P＜0.01），C-myc蛋白表達減弱（P＜0.05）。結(jié)論：桑黃多糖具有體內(nèi)外抑瘤作用，并能上調(diào)抑癌基因PTEN和下調(diào)癌基因C-myc的蛋白表達。

桑黃多糖；抑瘤作用；體內(nèi)；體外；肉瘤S180細胞；小鼠

桑黃是擔(dān)子菌亞門層菌綱多孔菌目多孔菌科針層菌屬的一種藥用真菌[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，桑黃主要成分桑黃多糖（Phellinus linteus）具有抗腫瘤、抗氧化、抗過敏、調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用[2-5]，其抗腫瘤機制的研究作為多糖研究的一大熱點正受到越來越多的關(guān)注[6]。本研究通過MTT法及流式細胞術(shù)觀察桑黃多糖對離體腫瘤細胞增殖的抑制作用和對腫瘤細胞凋亡的誘導(dǎo)作用，進而研究其抑制在體腫瘤生長的作用，同時運用免疫組化法初步探索桑黃多糖對抑癌基因PTEN與癌基因C-myc表達的影響，為進一步探究桑黃多糖的抗腫瘤機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

DNM-9606型酶聯(lián)免疫分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；NE950型熒光顯微鏡（美國Nexcope公司）；TX1型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；BD FACSCantoⅡ型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 藥品與試劑

桑黃采自泰山山區(qū)，由泰山醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室鑒定為多孔菌科真菌火木層孔菌桑黃的子實體；多糖成品桑黃多糖由泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提取、富集制得（醇提，得率：1.56%，純度：＞98%，批號：150401）；膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-FLUOS細胞凋亡檢測試劑盒（美國羅氏公司）；抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒（上海拓然生物科技有限公司）。

1.3 動物與細胞

KM小鼠，普通級，♀♂各半，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由泰安市生物制品研究所提供，動物許可證號：魯動質(zhì)D20120011。肉瘤S180細胞株購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所。

2 方法

2.1 體外試驗

2.1.1 MTT法檢測細胞抑制率 復(fù)蘇凍融的S180細胞，體外傳代培養(yǎng)，接種到96孔板，加入0（空白對照）、2、4、8 mg/mL的桑黃多糖溶液，每個濃度3個復(fù)孔，分別作用12、24、36、48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，細胞呈圓形，懸浮生長，加入MTT終止培養(yǎng)前每孔中再加入二甲基亞砜（DSMO）。最后在酶聯(lián)免疫分析儀上測定570 nm波長下的光密度（OD），重復(fù)試驗3次，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率＝（1－加藥孔OD值/空白對照孔OD值）×100%。

2.1.2 Hoechst 33258染色法檢測細胞凋亡情況 取“2.1.1”項下作用48 h的各孔細胞懸液，用醋酸-乙醇或Carnoy固定液固定，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗5 min，加Hoechst 33258工作液染色15 min，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3，用甘油-PBS（1∶9）的混合液封片，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

2.1.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將懸浮細胞在4℃下300×g離心5 min，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，加入100 μL結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）重懸細胞。加入5 μLAnnexinⅤ-異硫氰酸熒光素（FITC）和5μL碘化丙啶（PI），輕輕混勻，避光下室溫反應(yīng)10 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液，混勻。1 h內(nèi)用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。試驗重復(fù)6次。

2.2 體內(nèi)實驗

取小鼠40只，分別于左前肢腋下im S180細胞懸液（1×107mL－1）0.2 mL，建立S180細胞荷瘤小鼠模型。接種24 h后，造模小鼠隨機分成4組，每組10只，分別為對照組（蒸餾水）和桑黃多糖高、中、低劑量組（400、200、100 mg/kg，分別按人臨床用量的2、1、0.5倍換算而得）。對照組小鼠每日ig蒸餾水0.4 mL，其余小鼠每日ig相應(yīng)劑量的桑黃多糖溶液，每日1次，連續(xù)給藥12 d。末次給藥后24 h處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱量瘤體濕質(zhì)量，計算抑瘤率；取瘤組織，經(jīng)常規(guī)固定、石蠟包埋、切片后，免疫組化法觀察其中抑癌基因PTEN與癌基因C-myc蛋白表達，具體按試劑盒說明書操作。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用Excel錄入和處理，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示，檢驗方法采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 桑黃多糖對S180細胞體外增殖的抑制作用

與空白對照比較，2、4、8 mg/mL的桑黃多糖溶液作用后細胞的增殖抑制率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且與濃度和時間呈正相關(guān)。這表明桑黃多糖能顯著地抑制S180細胞增殖。不同濃度桑黃多糖作用不同時間后S180細胞增殖抑制率的測定結(jié)果見表1。

表1 不同濃度桑黃多糖作用不同時間后S180細胞增殖抑制率的測定結(jié)果Tab 1 Determination results of proliferation inhibition rate of S180 cells after phellinus linteus polysaccharide with different concentrations acting for different time

3.2 桑黃多糖對S180細胞體外凋亡的影響

空白對照的細胞呈彌散均勻熒光，色淺且淡，細胞核圓形或橢圓形、濃縮及碎裂現(xiàn)象。2、4、8 mg/mL的桑黃多糖溶液作用48 h后細胞核染色質(zhì)固縮濃染，集聚至核膜周邊。不同濃度桑黃多糖作用48 h后S180細胞的凋亡形態(tài)變化見圖1。

圖1 不同濃度桑黃多糖作用48 h后S180細胞的凋亡形態(tài)變化（×200）Fig 1 Changes of S180 cells apoptotic morphology after phellinus linteus polysaccharide with different concentrations acting for 48 h（×200）

3.3 桑黃多糖對S180細胞體外凋亡率的影響

與空白對照比較，2、4、8 mg/mL的桑黃多糖溶液作用48 h后細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且與濃度呈正相關(guān)。不同濃度桑黃多糖作用48 h后S180細胞凋亡的流式圖見圖2，測定結(jié)果見表2。

圖2 不同濃度桑黃多糖作用48 h后S180細胞凋亡的流式圖Fig 2 Flow cytometry of S180 cells apoptosis after phellinus linteus polysaccharide with different concentrations acting for 48 h

表2 不同濃度桑黃多糖作用48 h后S180細胞凋亡率的測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Determination results of apoptosis rate of S180 cells after phellinus linteus polysaccharide with different concentrations acting for 48 h（±s，n＝6）

表2 不同濃度桑黃多糖作用48 h后S180細胞凋亡率的測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Determination results of apoptosis rate of S180 cells after phellinus linteus polysaccharide with different concentrations acting for 48 h（±s，n＝6）

注：與空白對照比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

桑黃多糖質(zhì)量濃度，mg/mL 0（空白對照）248凋亡率，% 7.1±0.6 18.5±1.0＊＊49.4±0.9＊＊68.4±3.9＊＊早期凋亡率，% 3.4±0.5 7.9±1.1＊23.0±2.0＊38.5±3.1＊＊晚期凋亡率，% 3.8±0.6 9.1±2.0＊24.5±1.9＊＊30.9±1.5＊＊

3.4 桑黃多糖對小鼠S180肉瘤的抑瘤作用

與對照組比較，桑黃多糖各劑量組小鼠的抑瘤率明顯升高（P＜0.01），表明桑黃多糖可明顯延緩小鼠S180肉瘤腫瘤的生長。各組小鼠瘤質(zhì)量與抑瘤率的測定結(jié)果見表3。

3.5 桑黃多糖對小鼠腫瘤組織中PTEN、C-myc蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，PTEN為胞核陽性，C-myc為胞漿陽性。與對照組比較，桑黃多糖各劑量組小鼠腫瘤組織中PTEN蛋白表達增強（P＜0.05或P＜0.01），C-myc蛋白表達減弱（P＜0.05）。各組小鼠腫瘤組織中PTEN和C-myc蛋白表達的測定結(jié)果見表4，對照組和桑黃多糖高劑量組小鼠腫瘤組織中PTEN、C-myc蛋白表達的免疫組化圖見圖3。

表3 各組小鼠瘤質(zhì)量與抑瘤率的測定結(jié)果（±s）Tab 3 Determination results of tumor weight and tumor inhibition rate of mice in each group（±s）

表3 各組小鼠瘤質(zhì)量與抑瘤率的測定結(jié)果（±s）Tab 3 Determination results of tumor weight and tumor inhibition rate of mice in each group（±s）

注：與對照組比較，＊＊P＜0.01Note：vs.control group，＊＊P＜0.01

抑瘤率，%組別對照組桑黃多糖低劑量組桑黃多糖中劑量組桑黃多糖高劑量組結(jié)束31.54 41.54 46.92動物只數(shù)開始10 10 10 10 79 10 10體質(zhì)量，g開始20.03±0.36 20.74±1.21 20.74±1.02 20.62±0.98結(jié)束23.17±3.04 23.92±3.21 24.60±4.00 24.90±2.51瘤質(zhì)量，g 1.30±0.24 0.95±0.15＊＊0.87±0.02＊＊0.71±0.17＊＊

表4 各組小鼠腫瘤組織中PTEN和C-myc蛋白表達的測定結(jié)果（±s）Tab 4 Determination results of PTEN，C-myc protein expressions in tumor tissue of rats in each group（±s）

表4 各組小鼠腫瘤組織中PTEN和C-myc蛋白表達的測定結(jié)果（±s）Tab 4 Determination results of PTEN，C-myc protein expressions in tumor tissue of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組桑黃多糖低劑量組桑黃多糖中劑量組桑黃多糖高劑量組C-myc，% 43.30±1.20 37.02±0.39 27.78±0.13＊20.00±2.41＊動物只數(shù)開始10 10 10 10結(jié)束791 0 10 PTEN，% 5.21±0.20 13.63±0.00＊19.51±3.56＊＊28.11±3.11＊＊

圖3 對照組和桑黃多糖高劑量組小鼠腫瘤組織中PTEN、C-myc蛋白表達的免疫組化圖（SP，×400）Fig 3 Immunohistochemistry diagram of PTEN，C-myc protein expressions in tumor tissue of rats in control group and phellinus linteus polysaccharide high-dose group（SP，×400）

4 討論

桑黃作為一種藥食同源的真菌在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛，其主要成分桑黃多糖有一定的抗腫瘤作用，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤機制主要有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及抗血管生成的作用等[7-8]。本研究分別通過體外試驗、體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，桑黃多糖具有明顯的抗腫瘤作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，PTEN是繼p53之后又一抑癌基因，越來越多的研究顯示PTEN參與多種信號通路的傳導(dǎo)，其通過抑制腫瘤生長、誘導(dǎo)細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用，PTEN失表達是腫瘤發(fā)生的標(biāo)志之一[9-11]。C-myc基因是較早發(fā)現(xiàn)的一組癌基因，C-myc的擴增與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，亦可作為驗證抗腫瘤藥物發(fā)揮抗瘤作用的一個檢測指標(biāo)[12]。因此，探索桑黃多糖對PTEN與C-myc基因表達的影響對于從基因水平探索其抗腫瘤機制具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，桑黃多糖高、中、低劑量組均能明顯上調(diào)PTEN基因表達（P＜0.05或P＜0.01），亦能明顯下調(diào)C-myc基因表達（P＜0.05），提示桑黃多糖通過影響PTEN與C-myc基因表達水平發(fā)揮其抗腫瘤作用。

本研究為桑黃多糖抗腫瘤機制的進一步探索奠定了基礎(chǔ)，為促進桑黃的研發(fā)利用提供了重要參考價值。

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Antitumor Effect of Phellinus Linteus Polysaccharide on Sarcoma S180 Cells in vivo and in vitro

LIU Yanlin1，LIU Haiyan2，CHANG Jin2，DANG Heqin1（1.Dept.of Pharmacy，Affiliated Hospital of Taishan Medical University，Shangdong Tai’an 271000，China；2.Dept.of Oncology，Affiliated Hospital of Taishan Medical University，Shangdong Tai’an 271000，China）

OBJECTIVE：To study the antitumor effect of phellinus linteus polysaccharide on sarcoma S180 cells in vivo and in vitro.METHODS：Sarcoma S180 cells in logarithmic growth period were selected，adding into 0（blank control），2，4，8 mg/mL phellinus linteus polysaccharide solution and respectively culturing for 12，24，36，48 h.The in vitro proliferation inhibition rate of cells was determined by MTT method；its apoptotic morphology was observed by fluorescence staining and cell apoptosis rate was detected by flow cytometry.S180 tumor-bearing mice models were established and randomly divided into control group，phellinus linteus polysaccharide high-dose，medium-dose，low-dose groups（400，200，100 mg/kg），10 in each group.Model mice were intragastrically administrated related medicined，once a day，for 12 d.Mice were executed after 24 h of last administration，tumor weight was determined，tumor inhibition rate was calculated.Immunohistochemistry was conducted to detect the tumor suppressor gene PTEN and oncogene C-myc protein expressions in tumor tissue.RESULTS：Compared with blank control group，phellinus linteus polysaccharide can increase the proliferation inhibition rate of S180 cells and induce the increase of apoptosis rate（P＜0.05 or P＜0.01），showing a concentration-time manner.Compared with control group，the tumor inhibition rates in phellinus linteus polysaccharide groups were obviously increased（P＜0.01），PTEN protein expressions were strengthened（P＜0.05 or P＜0.01）and C-myc protein expressions were weakened（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Phellinus linteus polysaccharide shows antitumor effect in vivo and in vitro，which can up-regulate the PTEN，down-regulate C-myc protein expressions.

Phellinus linteus polysaccharide；Antitumor effect；in vivo；in vitro；Sarcoma S180 cells；Mice

R361+.3

A

1001-0408（2017）22-3069-04

2017-03-24

2017-05-25）（編輯：鄒麗娟）

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目（No.2015-264）

＊副主任藥師，副教授，碩士。研究方向：臨床藥學(xué)、藥理學(xué)。電話：0538-6236471。E-mail：tyfyypcg@163.com

#通信作者：主任藥師，教授。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0538-6237545。E-mail：d75766@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.12