陳 栘，徐海霞，朱明月，劉 坤，林 波，羅儒獻，陳川柏，李孟森#（1.海南醫(yī)學院分子生物學重點實驗室，?？?571199；2.海南省腫瘤發(fā)生和干預重點實驗室，?？?571199；.海南省安寧醫(yī)院精神科，?？?71199）

慢性低強度應激抑郁癥模型大鼠組織中5-羥色胺和色氨酸羥化酶的表達變化Δ

陳 栘1，2＊，徐海霞1，2，朱明月1，2，劉 坤1，2，林 波1，2，羅儒獻3，陳川柏3，李孟森1，2#（1.海南醫(yī)學院分子生物學重點實驗室，?？?571199；2.海南省腫瘤發(fā)生和干預重點實驗室，海口 571199；3.海南省安寧醫(yī)院精神科，?？?71199）

目的：為抑郁癥治療藥物的開發(fā)提供依據和思路。方法：將適應性喂養(yǎng)7 d的大鼠隨機分為正常組、抑郁組和治療組（氫溴酸西酞普蘭1 mg/kg），每組8只，抑郁組和治療組大鼠每天隨機給予1次低強度刺激[夾尾刺激（1 min）、頻閃照明刺激（120次/ min，12 h）、噪聲刺激（4 h）、冰水游泳刺激（1 h）、熱水刺激（45℃，1 h）、電擊足底（10 Hz，1 mA，每次間隔100 ms，100次）、禁食禁水（24 h）]，連續(xù)21 d建立應激抑郁癥模型。分別于適應性喂養(yǎng)第0、7天和應激第7、14、21天稱量各組大鼠體質量，檢測曠場實驗中大鼠的水平移動頻率和垂直活動頻率。應激結束后，各組大鼠ig相應藥物，連續(xù)30 d后檢測腦、肝、腎組織中5-羥色胺（5-HT）和色氨酸羥化酶（TPH）的表達。結果：與正常組比較，抑郁組和治療組大鼠從應激第14天起體質量增加趨勢減慢（P＜0.05）。抑郁組和治療組大鼠應激第14、21天的水平移動頻率較前一時間點明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），應激第21天的垂直活動頻率較前一時間點明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；給藥30 d后，治療組大鼠水平移動頻率和垂直活動頻率較前一時間點明顯升高（P＜0.01）。與抑郁組比較，治療組大鼠腦、腎組織中的5-HT水平明顯增加（P＜0.05），腦組織中TPH水平明顯增加（P＜0.05）。結論：應激大鼠模型抑郁癥的發(fā)生與大鼠腦組織中TPH表達的降低從而導致5-HT水平降低有關，提示TPH可作為抑郁癥治療的靶點。

抑郁癥模型；5-羥色胺；色氨酸羥化酶；大鼠

抑郁癥屬于情感障礙性疾病，主要特征是持續(xù)性的心境低落，并伴有情緒不振、食欲下降、體質量下降、活動頻率降低、失眠、疲勞、無望感以及自殺傾向等[1]。據世界衛(wèi)生組織預計，到2020年抑郁癥將成為僅次于冠心病之后的人類第二大疾病。然而，迄今為止抑郁癥的發(fā)病機制尚未明確，對于抑郁癥發(fā)病機制和治療手段的探索是目前醫(yī)學及生物學領域的研究熱點之一。

建立合理可靠的抑郁癥動物模型是研究抑郁癥發(fā)病機制和治療手段的先決條件。慢性低強度應激（CMS）抑郁癥動物模型是Willner P等[1]在1987年建立的，這種模型具有高度的有效性和可靠性，抑郁癥狀可持續(xù)2周以上，且抗抑郁藥物對其有治療作用，因此該模型基本符合抑郁模型的要求。

抑郁癥發(fā)生的5-羥色胺（5-HT）學說指出，抑郁癥是中樞神經系統(tǒng)中5-HT釋放量減少，使其在突觸間隙的含量降低所致。有研究已證實，抑郁癥患者的中樞神經系統(tǒng)中5-HT含量降低[2-3]。5-HT由色氨酸經兩步反應合成：（1）色氨酸由色氨酸羥化酶（TPH）催化生成5-羥色氨酸；（2）5-羥色氨酸在5-羥色氨酸脫羧酶的作用下最終生成5-HT。由于TPH在腦中的含量和活性較低，其成為5-HT合成的限速酶[4]。因此，筆者推測中樞神經系統(tǒng)中TPH表達水平和生理活性的降低導致5-HT釋放量的下降，繼而抑制了5-HT作為情緒性行為調節(jié)因子的作用，導致抑郁癥的發(fā)生。為驗證這個假設，本課題建立了CMS抑郁癥大鼠模型，采用免疫組織化學法對大鼠腦、肝、腎組織中5-HT和TPH的表達進行了檢測，以期為探索抑郁癥發(fā)病機制及研發(fā)抗抑郁藥物提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器

BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；Shandon Finesse E+石蠟切片機（美國Thermo Scientific公司）；IX51熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

氫溴酸西酞普蘭口服溶液（上海實業(yè)聯合集團長城藥業(yè)有限公司，批號：20130614，規(guī)格：10 mL∶20 mg）；大鼠源anti-5-HT抗體（貨號：ab6336，批號：GR83127-1）、兔源 anti-TPH抗體（貨號：ab52954，批號：YI060902CSR）、驢抗大鼠二抗（貨號：ab102182，批號：GR140392-3）、山羊抗兔二抗（貨號：ab6721，批號：GR113458-1）均購自美國Abcam公司；二甲苯、一水檸檬酸、二水檸檬酸鈉、牛血清白蛋白（BSA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：20110711、26219、34208、46769）；蘇木素（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；3， 3′-二氨基聯苯胺（DAB，北京索萊寶科技有限公司，批號：20131106）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠24只，♀♂各半，體質量為180～220 g，購自海南醫(yī)學院實驗動物中心（海南省藥物安全性評價研究中心），合格證號：SYXK（瓊）2012-0012。本實驗受海南醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會監(jiān)督及審查。

2 方法

2.1 分組、建模、給藥與取樣

大鼠按性別分籠常規(guī)適應性喂養(yǎng)7 d后，區(qū)分性別并隨機分為正常組、抑郁組和治療組，每組8只，♀♂各半。正常組大鼠在整個建模過程中保持正常飼養(yǎng)。抑郁組和治療組大鼠每天隨機給予1次低強度刺激[包括夾尾刺激（1 min）、頻閃照明刺激（120次/min，12 h）、噪聲刺激（4 h）、冰水游泳刺激（1 h）、熱水刺激（45℃，1 h）、電擊足底（10 Hz，1 mA，每次間隔100 ms，100次）、禁食禁水（24 h）]，連續(xù)21 d建立CMS抑郁癥模型。建模后，治療組大鼠每天按1 mg/kg劑量ig氫溴酸西酞普蘭口服溶液，正常組和抑郁組大鼠ig等量生理鹽水，連續(xù)30 d。治療結束后，各組大鼠麻醉、解剖，分離腦、肝、腎組織，快速放入－80℃超低溫冰箱中保存，待用。

2.2 大鼠體質量、水平移動頻率和垂直活動頻率的檢測

觀察各組大鼠的飲食情況，分別于適應性喂養(yǎng)的第0、7天，刺激應激第7、14、21天和給藥30 d后稱量每組大鼠體質量，并進行曠場實驗。取每組大鼠各時間點的體質量平均值，比較同組大鼠各時間點間體質量的增加趨勢。記錄并計算每組大鼠各時間點在曠場實驗中的水平移動頻率和垂直活動頻率的平均值，比較同組大鼠各時間點間運動頻率的變化趨勢。數據以Excel 2003軟件進行分析，正態(tài)計量指標以±s表示，兩兩比較行t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.3 大鼠腦、肝、腎組織中5-HT和TPH水平的檢測

采用免疫組織化學法檢測各組大鼠腦、肝、腎組織中的5-HT和TPH水平。將取樣得到的腦、肝、腎組織石蠟包埋，切片（厚度4 μm），烘烤固定到載玻片上。免疫組織化學法檢測時，先將載玻片浸入二甲苯5 min×3進行脫蠟，依次浸入100%、95%、70%乙醇中各3 min進行水化，再浸入蒸餾水5 min×2清洗后，浸入3%過氧化氫溶液室溫孵育5 min以封閉組織本身的過氧化物歧化酶；流水沖洗5 min，滴加2%BSA室溫孵育10 min封閉組織上空白位點，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗10 min×3，浸入檸檬酸緩沖液微波加熱10 s×6進行抗原修復；流水沖洗5 min后，滴加用PBS稀釋的大鼠源anti-5-HT抗體（1∶140稀釋）或兔源anti-TPH抗體（1∶200稀釋），4℃孵育過夜；PBST緩沖液（PBS+聚山梨酯20）清洗10 min× 3，滴加二抗（1∶1 000稀釋）37℃孵育30 min；PBST清洗10 min×3，滴加DAB室溫孵育2～10 min對目的蛋白進行染色，浸入蘇木素室溫孵育3 min復染細胞核；流水沖洗5 min，依次浸入70%、95%、100%乙醇中各5 min，再浸入二甲苯5 min×2，滴加一小滴中性樹脂后用蓋玻片封片。采用顯微鏡觀察，以Image-Pro Plus 6.0軟件對染色的平均積分光密度（IOD）分析。采用Excel 2003軟件進行數據處理，數據以±s（柱狀圖的誤差線）表示，組間數值行t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠體質量、水平移動頻率和垂直活動頻率變化

應激過程中，抑郁組和治療組大鼠均出現食欲下降的癥狀。與正常組比較，抑郁組和治療組大鼠從應激第14天起體質量增加趨勢減慢（P＜0.05）。與抑郁組比較，治療組大鼠給藥30 d后體質量明顯增加（P＜0.05）。

曠場實驗中，正常組大鼠不同時間點間水平移動頻率和垂直活動頻率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。抑郁組和治療組大鼠應激第14、21天的水平移動頻率與前一時間點比較明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；應激第21天的垂直活動頻率與前一時間點比較明顯降低（P＜0.05）。給藥30 d后，治療組大鼠水平移動頻率和垂直活動頻率與前一時間點比較明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠體質量、水平移動頻率和垂直活動頻率的變化趨勢見圖1。

圖1 各組大鼠體質量、水平移動頻率和垂直活動頻率的變化趨勢（n＝8）Fig 1 Change trends of body mass，horizontal activity and vertical activity frequencies of rats in each group（n＝8）

3.2 大鼠不同組織中5-HT含量變化

與正常組比較，抑郁組大鼠腦、腎組織中5-HT含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與抑郁組比較，治療組大鼠腦、腎組織中5-HT含量明顯增加（P＜0.05）。各組大鼠腦組織中5-HT含量較肝、腎組織低。3組大鼠肝組織中5-HT含量變化不明顯。各組大鼠不同組織中5-HT含量的免疫組織化學圖見圖2，測定結果見圖3。

圖2 各組大鼠不同組織中5-HT水平的免疫組織化學圖（×200）Fig 2 Immunohistochemistry diagram of 5-HT levels in different tissues of rats in each group（×200）

圖3 各組大鼠不同組織中5-HT水平的測定結果（n＝8）Fig 3 Determination results of 5-HT levels in different tissues of rats in each group（n＝8）

3.3 大鼠不同組織中TPH水平變化

與正常組比較，抑郁組大鼠腦、腎組織中TPH水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與抑郁組比較，治療組大鼠腦組織中TPH水平明顯增加（P＜0.05），腎組織中TPH水平繼續(xù)降低。抑郁組大鼠腦組織中TPH水平降低趨勢較肝、腎組織明顯。各組大鼠不同組織中TPH水平的免疫組織化學圖見圖4，測定結果見圖5。

4 討論

抑郁癥動物模型的建立是探索抑郁癥發(fā)生機制和治療方法的基礎，常見的模型建立方法包括藥物誘發(fā)抑郁模型、應激模型、分離模型等，其中應用較為廣泛、模型建立方式較為接近人抑郁癥發(fā)生的CMS模型就屬于應激模型的一種。CMS模型的建立原則及該模型的優(yōu)勢體現在以下兩點：（1）在有效范圍內盡可能降低應激因子的強度，以模擬人類抑郁癥發(fā)生的中慢性及應激源低水平性；（2）以人類抑郁的核心癥狀，即快感缺乏為依據，利用快感測試監(jiān)控和評價大鼠應激的形成。本課題采用的曠場實驗即快感測試的一種，本實驗建立的抑郁癥模型大鼠呈現快感下降癥狀。

圖4 各組大鼠不同組織中TPH水平的免疫組織化學圖（×200）Fig 4 Immunohistochemistry diagram of TPH levels in different tissues of rats in each group（×200）

圖5 各組大鼠不同組織中TPH水平的測定結果（n＝8）Fig 5 Determination results of TPH levels in different tissues of rats in each group（n＝8）

近年來，抑郁癥發(fā)生的神經遞質學說取得了很大的進展。目前已發(fā)現與抑郁癥發(fā)生相關的神經遞質包括去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）和5-HT等。5-HT是一個重要的情緒性行為的調節(jié)因子，在腦內參與情感控制、睡眠、進食、體溫調節(jié)、藥物依賴和性行為等多種生理功能的調節(jié)[5-6]。因此，選擇性抑制5-HT的重吸收也是抗抑郁藥物的藥理作用之一[7]。由此可見，5-HT與抑郁癥有著密切聯系，就5-HT及其相關蛋白的研究對探索抑郁癥的發(fā)病機制和治療方法具有重要意義。本文選用的抗抑郁藥西酞普蘭是一種選擇性5-HT再攝取抑制劑（SSRIs），與同類藥比較，其再攝取抑制作用更強、選擇性更高[8]。本實驗選用的劑量以藥品說明書為依據換算而得。

本研究結果顯示，抑郁組大鼠腦組織中5-HT水平較肝、腎組織低，這個結果與抑郁癥發(fā)生的5-HT學說及國內外相關報道一致[2-3，9-10]。中樞神經系統(tǒng)中5-HT雖然可對情緒性行為起調控作用，但只占體內5-HT總量的一小部分[8]。然而，作為5-HT合成限速酶的TPH在各組織中的分布卻不同于5-HT，這也許是因為TPH的兩個亞型TPH1和TPH2分別分布于外周和中樞，其催化機制也許存在差異。5-HT與TPH組織分布的差異性有可能與其在肝、腎組織中含量變化趨勢不同相關。本研究結果也充分輔證了抑郁癥發(fā)生的5-HT學說，同時TPH在抑郁癥大鼠模型腦組織中表達改變與5-HT含量的改變呈現相同的趨勢，證實了抑郁癥發(fā)生的5-HT學說可能與其合成的限速酶TPH相關。

（致謝：感謝海南醫(yī)學院分子生物學重點實驗室李孟森主任對本課題實驗技術的指導和資助；感謝海南醫(yī)學院2011級本科實習生徐海霞協助本課題的實驗操作；感謝海南醫(yī)學院分子生物學重點實驗室的同事在實驗技術上的指導和幫助！）

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Changes of 5-hydroxytryptamine and Tryptophan Hydroxylase Expressions in Tissues of Depression Model Rats Induced by Chronic Low-intensity Stress

CHEN Yi1，2，XU Haixia1，2，ZHU Mingyue1，2，LIU Kun1，2，LIN Bo1，2，LUO Ruxian3，CHEN Chuanbai3，LI Mengsen1，2
（1.Key Laboratory of Molecular Biology，Hainan Medical University，Haikou 571199，China；2.Hainan Provincial Key Laboratory of Carcinogenesis and Intervention，Haikou 571199，China；3.Dept.of Psychiatry，Hainan Anning Hospital，Haikou 571199，China）

OBJECTIVE：To provide basis and thinking for the development of medicines for treating depression.METHODS：Rats with adaptive feeding for 7 d were randomly divided into normal group，depression group and treatment group（citalopram hydrobromide 1 mg/kg），8 in each group.Rats in depression group and treatment groups randomly

once low-density stimulation in a day[catching tail stimulation（1 min），frequent flashing stimulation（120 times/min，12 h），noise stimulation（4 h），ice water swimming stimulation（1 h），hot water stimulation（45℃，1 h），electric shocking foot（10 Hz，1 mA，each time interval of 100 ms，100 times），no food and no water（24 h）]for 21 d to reduce stress depression model.Body mass of rats in 0，7 d of adaptive feeding and 7，14，21 d of stress were respectively weighed，and horizontal activity and vertical activity frequencies in open field test were detected.After stress，rats were intragastrically administrated related medicines for 30 d，then 5-hydroxytryptamine（5-HT）and tryptophan hydroxylase（TPH）expressions in brain，liver，kidney tissues were determined.RESULTS：Compared with normal group，the increasing trend of body mass in depression group and treatment group slowed down from the 14 d of stress（P＜0.05）.The horizontal activity frequencies in depression group and treatment group in 14，21 d of stress slowed more obviously than the previous time point（P＜0.05 or P＜0.01）；vertical activity frequencies in 21 d of stress slowed more obviously than the previous time point（P＜0.05 or P＜0.01）.After 30 d of administration，horizontal activity and vertical activity frequencies in treatment group were increased more obviously than the previous time point（P＜0.01）.Compared with depression group， 5-HT level in brain，kidney tissues was obviously increased（P＜0.05）and TPH level was obviously increased in brain tissue（P＜0.05）.CONCLUSIONS：The occurrence of depression in stress rat models may be associated with the decrease of 5-HT content induced by the decrease of TPH expression inbrain tissue of rats，indicating that TPH can be used as a target for depression treatment.

Depression model；5-hydroxytryptamine；Tryptophan hydroxylase；Rats

R965

A

1001-0408（2017）22-3061-04

2017-03-24

2017-06-02）

（編輯：鄒麗娟）

海南省自然科學基金資助項目（No.812162，813198）

＊助理研究員，碩士。研究方向：分子腫瘤學。電話：0898-66893780。E-mail：chenyioi@163.com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：分子腫瘤學。電話：0898-66895322。E-mail：mengsenli@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.10