胡興義,張雙翔,馮旭芳,丁尊俄,劉麗娟,蒲翠敏,張 海,周碧君,王開(kāi)功＊

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州省動(dòng)物疫病研究室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550001；4.貴州省德江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 德江 565200）

豬流行性腹瀉病毒與鏈球菌混合感染的診斷

胡興義1.2,張雙翔3,馮旭芳4,丁尊俄1.2,劉麗娟1.2,蒲翠敏1.2,張 海1.2,周碧君1.2,王開(kāi)功1.2＊

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州省動(dòng)物疫病研究室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550001；4.貴州省德江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 德江 565200）

隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；?、集約化發(fā)展，豬病毒性腹瀉已成為威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要原因之一。豬病毒性腹瀉的病因十分復(fù)雜，主要的病原有豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)和豬嵴病毒(PKV)。這4種病毒均能引起豬的腸道傳染病，感染后主要表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水和仔豬的高死亡率，各種年齡的豬均易感染，其中對(duì)哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)100%[1]。這4種病原所致腹瀉其臨床癥狀和病理變化極其相似。此外，當(dāng)前豬腹瀉也多存在細(xì)菌感染，如大腸桿菌、鏈球菌、沙門氏菌和豬丹毒等感染所致，且存在混合感染的情況，單從臨床上鑒別診斷較難，給養(yǎng)殖戶專業(yè)技術(shù)人員用藥增加難度[2]。因此通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)對(duì)豬腹瀉進(jìn)行病原診斷尤其重要，也為豬腹瀉疫病的診斷和藥物選擇提供幫助。

2017年2月貴州省貴陽(yáng)市某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)生腹瀉大流行，導(dǎo)致其哺乳仔豬大量死亡。筆者通過(guò)對(duì)該豬場(chǎng)3頭哺乳弱仔豬進(jìn)行剖檢和實(shí)驗(yàn)室診斷，特做如下報(bào)道。

1 材料

1.1 臨床樣本

來(lái)自貴州省貴陽(yáng)市某種豬場(chǎng)3頭產(chǎn)房哺乳弱仔豬。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PrimeScriptTMRT Master Mix購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；新生牛血清購(gòu)自浙江天航生物科技有限公司。草酸銨結(jié)晶紫、革蘭氏碘液、95%酒精、沙黃染液、生理鹽水由貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法

2.1 剖檢病理觀察

對(duì)送檢的3頭哺乳弱仔豬進(jìn)行解剖，沿其腹白線切開(kāi)，鈍性剝離腹內(nèi)膜，觀察其免疫器官和腸道的病理情況。采集其腸道組織和糞便。

2.2 病原核酸檢測(cè)

取送檢豬的糞便、腸等組織，研磨，離心提取上清，采用北京世紀(jì)元亨豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)試劑盒提取總RNA，針對(duì)PEDV 特異性引物(目的片段444 bp)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過(guò)1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)PEDV M基因保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，并送上海英俊生物有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

2.4 反應(yīng)體系建立

反應(yīng)體系為25μL，2×Taq PCRMasterMix 12．5 μL，上下游引物各1μL，模板RNA 2μL，滅菌ddH2O8．5μL。

表1 引物序列

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸7 min，4 ℃保存。

PCR反應(yīng)結(jié)束后， PCR產(chǎn)物經(jīng)1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察其結(jié)果。

2.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)

取送檢豬的肝臟、肺臟、腎臟、空腸、心臟以及脾臟等組織分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，并挑取單個(gè)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色及顯微鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1 剖檢病理變化結(jié)果

對(duì)送檢的3頭哺乳弱仔豬進(jìn)行剖檢，表現(xiàn)腸系膜淋巴結(jié)出血，頜下淋巴結(jié)出血等癥狀。主要剖檢圖片如圖1和圖2。

圖1 頜下淋巴結(jié)出血

圖2 腸系膜淋巴結(jié)出血

3.2 病原核酸檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)送檢的3頭哺乳弱仔豬進(jìn)行取材，經(jīng)總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，取7 μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于1．2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。結(jié)果顯示，豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，擴(kuò)增條帶與預(yù)期結(jié)果一致，表明送檢3頭哺乳弱仔豬為PEDV感染所引起，見(jiàn)圖3。

表2 分離細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖3 檢測(cè)結(jié)果

3.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

取送檢的3頭哺乳弱仔豬的肝臟、肺臟、腎臟、空腸、心臟以及脾臟等組織分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，可見(jiàn)多種臟器分離到細(xì)菌（見(jiàn)圖4）。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，肝臟和心臟部位接種所生長(zhǎng)的細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，生化鑒定初步確定為鏈球菌(見(jiàn)圖5)。

圖4 取組織做細(xì)菌培養(yǎng)

圖5 挑取細(xì)菌制片進(jìn)行顯微鏡觀察

3.4 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖6 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)

挑取純化細(xì)菌做藥物敏感試驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，結(jié)果見(jiàn)圖6和表2。由表2結(jié)果可見(jiàn)，分離到的細(xì)菌對(duì)多種藥物均不敏感，可用腸道康等相似藥物進(jìn)行防控。

4 小結(jié)

通過(guò)對(duì)送檢的3頭哺乳弱仔豬樣本進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒病原核酸檢測(cè)，結(jié)果顯示，送檢樣本中均存在豬流行性腹瀉病毒感染，建議加強(qiáng)免疫。尤其是哺乳仔豬階段，臨床上建議采用跟胎免疫方法，使哺乳仔豬獲得保護(hù)性抗體。經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)顯示，該豬場(chǎng)存在鏈球菌感染，在寒冷季節(jié)應(yīng)加強(qiáng)哺乳仔豬飼養(yǎng)管理，強(qiáng)化豬舍環(huán)境衛(wèi)生管理，提高圈舍內(nèi)的溫度，及時(shí)補(bǔ)糖補(bǔ)液、適時(shí)止瀉、按時(shí)驅(qū)蟲及免疫，定期消毒，消毒藥物的種類交替使用。

[1] SUN RUI QIN， CAIRU JIAN， CHEN YA QIANG， et al． Outbreak ofporcine epidemi c diarrhea in sucking piglets， China [J]． Em erg Infect Dis， 2012， 18(1)： 161-163．

[2] 胡興義，張雙翔，金志強(qiáng)，等． 貴州地區(qū)仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J]．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38(7)：542-545．

2017-04-02)

“貴州省仔豬腹瀉性疫病風(fēng)險(xiǎn)分析及綜合防控技術(shù)研究”(黔科合NY[2015]3009-1號(hào))；“貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目”(研農(nóng)2017007）；“貴州省動(dòng)物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生保障科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)”(黔科合人才團(tuán)隊(duì)[2015] 4016號(hào))。

胡興義（1990-），男，貴州織金人，在讀碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail：997263065@qq.com。

* 通信作者:王開(kāi)功，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:kaigongwang@aliyun.com