王效蕊 梁泰剛

（山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001）

青藤堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)人肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

王效蕊 梁泰剛*

（山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001）

目的研究青藤堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)人肝細(xì)胞（HLO2）損傷的保護(hù)作用。方法以H2O2損傷HL02細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果青藤堿能明顯改善H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，與模型組相比，青藤堿可提高細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞的凋亡率。結(jié)論青藤堿對(duì)H2O2所致的HL02細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。

青藤堿；H2O2；HL02；細(xì)胞損傷；凋亡

作為人體最主要的代謝器官，肝臟容易受到各種因素所導(dǎo)致的損傷，而肝損傷是導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌的直接病因[1]。目前研究表明，氧化應(yīng)激與肝損傷密切相關(guān)，氧化應(yīng)激可以啟動(dòng)膜脂質(zhì)過(guò)氧化，從而破壞肝細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[2]。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)一些天然活性物質(zhì)能夠通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平發(fā)揮肝保護(hù)作用[3]。

青藤堿（sinomenine）是從防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤莖中提取的一種生物堿單體。青藤堿生物活性很多，包括抗炎、抗心律失常、鎮(zhèn)痛、降壓、免疫抑制等多種藥理作用，除此之外，青藤堿還具有清除氧自由基和抗氧化作用[4-5]。本文以H2O2刺激HL02細(xì)胞建立肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，旨在研究青藤堿對(duì)體外肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：CO2培養(yǎng)箱（Heal Force HP90，上海力申科學(xué)儀器有限公司）；垂直層流超凈臺(tái)（Boxun，上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；流式細(xì)胞儀（BD-C6，USA）；Variskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）。

1.1.2 細(xì)胞株：HL02細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 試劑：青藤堿（上海阿拉丁試劑有限公司，純度＞97%）；含EDTA的胰酶、無(wú)EDTA的胰酶、青鏈霉素雙抗混合液、1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Invitrogen Life Technologies，Inc.，USA）；噻唑藍(lán)（Sigma，USA）；雙染凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)：HL02細(xì)胞置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，在5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液1次，2～3 d傳代1次，10代以內(nèi)細(xì)胞用于下述實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 H2O2誘導(dǎo)HL02細(xì)胞損傷模型的建立：加入終濃度為200、400、600 μmol/L H2O2，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組，每組為4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，檢測(cè)細(xì)胞存活率[6]，確定H2O2最佳損傷作用濃度。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)：處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用胰酶消化后，按5×104個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，先加入不同濃度（5、10、20 μmol/L）青藤堿培養(yǎng)12 h，再加入終濃度為400 μmol/L H2O2共同培養(yǎng)6 h，檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 雙染法：消化后的細(xì)胞，直接種于6孔板中，每孔1×105個(gè)/孔，細(xì)胞經(jīng)青藤堿和H2O2處理后（按照MTT實(shí)驗(yàn)中的處理步驟），用無(wú)EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS沖洗3遍，再重懸于200 μL binding buffer溶液中，每個(gè)樣本加入5 μL Annexin V和5 μL PI，避光培養(yǎng)15 min，在1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)[6]。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2誘導(dǎo)HL02細(xì)胞損傷模型的建立：細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果表明H2O2可以濃度依賴性地?fù)p傷HL02細(xì)胞（表1），根據(jù)結(jié)果本研究選用H2O2400 μmol/L為最佳作用濃度。

2.2 青藤堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)HL02細(xì)胞活力下降的影響：與陰性對(duì)照組相比較，模型組的細(xì)胞存活率下降為（56.31±2.43）%（P＜0.01），加入不同濃度的青藤堿保護(hù)后，細(xì)胞活力依次明顯上升（表2）。

2.3 青藤堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)HL02細(xì)胞凋亡的影響：見(jiàn)表2。H2O2培養(yǎng)細(xì)胞6 h細(xì)胞的凋亡率為（25.07±1.50）%，與陰性對(duì)照組相比具有明顯的差異，加入不同濃度的青藤堿后，細(xì)胞凋亡率逐漸下降，并且具有劑量依賴性。

表1 H2O2對(duì)正常HL02細(xì)胞損傷的影響（）

表1 H2O2對(duì)正常HL02細(xì)胞損傷的影響（）

注：與陰性對(duì)照組相比，##P＜0.01

表2 青藤堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)HL02細(xì)胞活力和凋亡率變化的影響（

表2 青藤堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)HL02細(xì)胞活力和凋亡率變化的影響（

注：與陰性對(duì)照組相比，##P＜0.01，與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

青藤堿濃度(μmol/L) 細(xì)胞存活率(%) 總凋亡率(%)陰性對(duì)照組 - 100 4.63±3.10 56.31±2.43## 25.07±1.50##5 64.44±1.56* 20.05±1.92* 10 74.90±4.19** 14.16±2.26** 20 83.84±3.74** 12.74±0.65** 0 H2O2處理組

3 討 論

氧化應(yīng)激是細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)和氧化系統(tǒng)失衡造成細(xì)胞氧化損傷的一種現(xiàn)象。肝細(xì)胞的氧化損傷是酒精性肝病、自身免疫性肝疾病、慢性毒性肝炎、肝硬化甚至肝癌等多種肝性疾病的共同特征，與肝組織壞死、細(xì)胞凋亡、肝功能下降密切相關(guān)[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)以H2O2損傷HL02細(xì)胞為損傷模型，研究青藤堿對(duì)H2O2損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明青藤堿可以濃度依賴性地抑制H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞活力的下降。流式雙染法是經(jīng)典的測(cè)定細(xì)胞凋亡率的方法，結(jié)果表明青藤堿可以減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率的升高。初步認(rèn)為青藤堿可以保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的HL02細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示青藤堿可用于預(yù)防肝性疾病的發(fā)生，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] 覃慧敏,田衛(wèi)群.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)不同移植途徑治療終末期肝病[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2011,5(21):6416-6418.

[2] 張劍平,魏紅山,孫靜媛,等.脂質(zhì)過(guò)氧化在乙型肝炎后肝硬化,急性乙型肝炎,重型乙型肝炎的損傷作用[J].世界華人消化雜志, 2005,13(12):1465-1466.

[3] 王忠雷,楊麗燕,張小華,等.天然產(chǎn)物抗氧化活性成分研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2012,35(5):386-389.

[4] 朱士龍,陳迪釗,李勇,等.青藤堿的最新研究進(jìn)展[J].吉首大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,32(5):95-100.

[5] 劉剛,王輝,張先洲,等.青藤堿清除氧自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用[J].中草藥,2006,31(1):84-87.

[6] 宋穎,李塵遠(yuǎn),張孟姝,等.銀杏內(nèi)酯B對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床,2015,31(5):23-27.

[7] 顧偉,范昕建,吳疆,等.胡黃連苷Ⅱ?qū)2O2損傷L-02細(xì)胞的保護(hù)作用[J].世界華人消化雜志,2008,16(29):3274-3278.

[8] 嵇月峨,施文艷,楊儉.?；撬釋?duì)大鼠心肌缺血再灌注后肝損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2012,11(34):69-70.

R575

B

1671-8194（2017）19-0052-02

山西省2014年高校優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人才項(xiàng)目資助；國(guó)家自然基金（NO81101687）資助

*通訊作者：E-mail:ltaigang@163.com