林松青，王 彬，周 潔，陳 宇，范世珍

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳518000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410000)

補腎活血中藥促成骨增殖靶效應(yīng)抗骨質(zhì)疏松的機制研究

林松青1，王 彬1，周 潔2，陳 宇1，范世珍1

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳518000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410000)

骨質(zhì)疏松癥(OP)是臨床中常常遇見的骨疾病,是引起全身骨量降低的主要因素,進(jìn)而導(dǎo)致骨微結(jié)構(gòu)毀壞以及骨密度降低,增加骨脆性因而易于發(fā)生骨折[1]，嚴(yán)重者甚至威脅生命。目前西醫(yī)臨床用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要有雌激素、降鈣素以及阿倫磷酸鹽等藥物，其臨床療效尚可，但副作用也多。研究表明[2]，人們隨著年齡的增加，胃腸道、肝腎功能也隨之衰退，老年人長期用藥后容易導(dǎo)致藥物在體內(nèi)蓄積，副作用明顯增大，且對治療骨質(zhì)疏松的療效明顯降低。中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥主要從“腎主骨”論治，輔以活血，能夠明顯的緩解骨質(zhì)疏松患者的臨床癥狀及生活質(zhì)量的提高。研究表明，補腎活血中藥通過加快成骨細(xì)胞的增殖分化進(jìn)而增快骨形成，但中藥促進(jìn)成骨，抑制骨吸收的效應(yīng)與機制尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路是其作用的重要靶點。NF-κB信號通路在成骨細(xì)胞分化、增殖及凋亡中有著關(guān)鍵的作用，同時還能介導(dǎo)骨組織的生長發(fā)育。本實驗通過體外實驗來分析NF-κB信號通路在補腎活血中藥抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成過程中的作用機制，探討NF-κB信號通路相關(guān)基因成骨分化的分子功能，從細(xì)胞分子學(xué)角度分析補腎活血中藥防治骨質(zhì)疏松癥的科學(xué)依據(jù)及作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料 補腎活血方(主要成分為補骨脂、熟地、黃芪、山茱萸、當(dāng)歸)的提取藥物，最后提煉制成中藥凍干粉(康美藥業(yè)公司提供)。成骨細(xì)胞由SD大鼠頭蓋骨分離培養(yǎng)；破骨細(xì)胞由四肢骨分離培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取一日齡SD大鼠麻醉下處死,以75%酒精浸泡15 min,取出頭蓋骨,以DMEM洗凈、剪為1立方毫米大小的骨塊,接著將附著軟組織剔凈,獲取其細(xì)胞,再用PBS緩沖液沖洗,放于NCS-MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng),培養(yǎng)液濃度為10%。接著靜置培養(yǎng)于37℃ 5%CO2中,時間間隔2天換1次培養(yǎng)液,棄去原培養(yǎng)液,然后于胎牛血清MEM中開始培育,培養(yǎng)液濃度為10%。直到單層細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底,時間通常為4-7天。觀察到細(xì)胞開始傳代時,先把原培養(yǎng)液倒掉,然后選用D-Hank’s液對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行沖刷,消化選用0.25%胰蛋白酶,倒掉消化液后再倒入培養(yǎng)液,接著對培養(yǎng)瓶底進(jìn)行吹打,促使細(xì)胞脫落,從而制成細(xì)胞懸液,最后接種于新的培養(yǎng)瓶,放置于37℃、5%CO2中靜置繼續(xù)培育。

1.2.2 破骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 麻醉下取SD大鼠的四肢長骨,然后沖洗大鼠骨髓,過80目篩，移于試管中，加培養(yǎng)液混勻，取下2/3的培養(yǎng)液，用10%牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，3 h后更換培養(yǎng)液， 2 d后再次更換培養(yǎng)液，持續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共育體系的創(chuàng)設(shè) 先對破骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),再對成骨細(xì)胞計數(shù),用培養(yǎng)液調(diào)整成骨細(xì)胞數(shù),使成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)目之比為10∶1、100∶1,將其種植于24孔板中,用含有1mM的B-甘油磷酸鈉培養(yǎng)細(xì)胞6h后,取成功培育的破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞進(jìn)行貼面培養(yǎng),收集成骨細(xì)胞,對細(xì)胞堿性磷酸酶的含量及活性進(jìn)行檢測并對細(xì)胞堿性磷酸酶染色。。

1.2.4 藥物制備 用煎煮法以水為溶劑提取中藥配方的有用成分，最后得到藥材重量：中藥水提液=1∶1～1∶1.5，冷卻后，往水提液中一邊放入無水乙醇一邊攪拌至乙醇濃度為 50%-60%，靜置6 h。抽濾，棄去沉淀，將濾液蒸發(fā)濃縮至稠膏狀，真空干燥，得凍干粉。DMEM 培養(yǎng)基稀釋成母液，放入培養(yǎng)基中干預(yù)細(xì)胞。

1.2.5 實驗分組 按照細(xì)胞生長情況換補腎活血中藥血清培養(yǎng)液；實驗分A 組(誘導(dǎo)劑+中藥血清低濃度組 50 μg/ml)、B 組(誘導(dǎo)劑+中藥血清中濃度組100 μg/ml)、C組(誘導(dǎo)劑+中藥血清高濃度組 200 μg/ml)、D組(空白對照組，培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)基)、E組(誘導(dǎo)劑組：完全培養(yǎng)基加入地塞米松、維生素C、甘油磷酸)、F組(NF-kB信號通路的特異性抑制劑IKK-DN 組)。

1.2.6 DAPI染色法檢測細(xì)胞凋亡 把用0.25%胰蛋白酶消化后的細(xì)胞分別放入10%含藥血清培養(yǎng)7天,放入TNF-α,分別于12 h、24 h后選出長有成骨細(xì)胞的蓋玻片,投入95%酒精固定15-30 min,微干,染色1 min。0.1M CaCl2處理2 min。用PBS漂洗幾次,每次漂洗時間一般為持續(xù)3秒。緊接著用PBS封片,放置于Nikon熒光顯微鏡下直接觀察并照相。

1.2.7 ELISA 法檢測培養(yǎng)液中RANK濃度 干預(yù)培養(yǎng)48 h取培養(yǎng)液。每孔分別放入樣品、樣品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)品各100 μl,37℃溫育30 min后分別放入酶標(biāo)偶合液、底物、終止液50 μl于450 nm波長讀取OD值。樣品、標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)復(fù)孔，每個樣本重復(fù)1次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)、Ⅰ型膠原免疫組化及堿性磷酸酶活性檢測判定為成骨細(xì)胞。見圖1。

A：形態(tài)學(xué) B：Ⅰ型膠原免疫組化和堿性磷酸酶活性檢測

2.2 破骨細(xì)胞鑒定

經(jīng)酒石酸TRACP染色判定為破骨細(xì)胞。見圖2。

2.3 成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共育體系判定

顯微鏡下觀察可見破骨細(xì)胞胞漿呈紅色陽性反應(yīng)，胞核呈陰性。見圖3。

圖2 破骨細(xì)胞鑒定

圖3 成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共育體系鑒定

2.4 補腎活血中藥提高ALP活性

與空白對照組比較補腎活血中藥低濃度組，誘導(dǎo)劑組明顯提高ALP活性，抑制劑組明顯降低ALP活性，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 補腎活血方對ALP活性的影響

注：與空白對照組相比，*P<0.05。

2.5 補腎活血中藥減少細(xì)胞凋亡

DAPI染色是一種采用經(jīng)典的DAPI進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測的快速簡便的方法。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的時候，染色質(zhì)會濃縮，DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀看，正常細(xì)胞的細(xì)胞核一般呈藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會呈緊密濃染，或呈碎塊狀緊密濃染，同時顏色略顯白色。

補腎活血方低、中、高濃度組明顯減低細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)劑明顯增加細(xì)胞凋亡，抑制劑明顯減低細(xì)胞凋亡。見圖4。

圖4 細(xì)胞凋亡圖

2.6 補腎活血中藥升高RANK濃度

與空白對照組比較補腎活血方低、中、高濃度組、誘導(dǎo)劑組、抑制劑組均明顯升高RANK濃度，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 補腎活血方對培養(yǎng)液RANK濃度的影響±s)

注：與空白對照組相比，*P<0.05。

3 討論

依據(jù)骨質(zhì)疏松癥的病因病機和臨床體征,其與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“骨枯”“骨痿”疾病癥狀相似。中醫(yī)認(rèn)為,補腎重在溫補腎陽,填補腎精。補腎活血中藥主要為補骨脂、熟地、黃芪、山茱萸、淫羊藿等組成,全方具有壯骨補腎,通絡(luò)活血的作用。研究表明[3,4],方中中藥淫羊藿的提取液對增長的礦化物沒有作用,然而對去睪丸后骨高轉(zhuǎn)化率能夠有效控制。且該藥對激素減少類骨質(zhì)疏松(OP)具有明顯防治作用,可抑制骨吸收。謝華[5]等經(jīng)過對中藥黃芪水提取液對防治大鼠類固醇性骨質(zhì)疏松影響的觀察,表明激素組骨吸收較黃芪水提取液組增高69%,同時新骨的形成降低100%,骨小梁面積減少27%,從而表明黃芪能明顯防治類固醇性O(shè)P。史風(fēng)芹等[6]發(fā)現(xiàn)高濃度的大黃可有效控制破骨細(xì)胞骨吸收,抑制破骨細(xì)胞在骨片上的侵蝕,使骨片上骨陷窩的數(shù)量明顯減少,然后將高濃度的大黃稀釋后,對破骨細(xì)胞在骨片上侵蝕的抑制性明顯降低。國內(nèi)外臨床研究已證實,補腎活血中藥能促進(jìn)骨形成,抑制骨吸收[7，8],且可以明顯改善骨質(zhì)疏松癥患者的癥狀[9]及緩解疼痛。

本實驗研究結(jié)果證實，補腎活血中藥能夠增進(jìn)成骨細(xì)胞的表達(dá)而有效控制破骨細(xì)胞的分化，通過實驗組各組間對比，證實NF-kB信號通路在骨代謝中的作用是促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化而抑制成骨細(xì)胞的形成，這與以往臨床研究的結(jié)果相一致[10]。研究已證實，OP的發(fā)生[11,12]是由于成骨細(xì)胞增殖分化的抑制或成骨細(xì)胞凋亡進(jìn)程的加速，進(jìn)而使骨形成少于骨吸收。NF-κB信號通路對成骨細(xì)胞的增殖分化以及凋亡過程都有著關(guān)鍵的作用。同時，破骨細(xì)胞對骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡起著關(guān)鍵的作用，而NF-κB信號通路的活化被稱為是成熟破骨細(xì)胞存活[13]和發(fā)揮功能[14]的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血中藥低濃度組明顯增高ALP活性，抑制劑明顯減低ALP活性，與空白對照組對比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。補腎活血中藥低、中、高濃度組明顯增高RANK濃度，與空白對照組對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；抑制劑組明顯增高RANK濃度。補腎活血中藥低、中、高濃度組明顯減低細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)劑明顯增加細(xì)胞凋亡，抑制劑明顯減低細(xì)胞凋亡，與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明補腎活血中藥可以提高ALP活性，減低細(xì)胞凋亡，增高RANK濃度，并通過調(diào)控NF-κB信號通路增進(jìn)成骨細(xì)胞的表達(dá)而有效控制破骨細(xì)胞的分化，從而抗骨質(zhì)疏松。

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2015年廣東省中醫(yī)藥管理局課題( 20152063)，2015年深圳市科技研發(fā)資金基礎(chǔ)研究資助項目 (JCYJ2015033109 0820169)

1007-4287(2017)08-1443-04

林松青，男，46歲，主任中醫(yī)師，教授，碩導(dǎo)，從事中醫(yī)骨傷研究.

2016-04-24)