侯文仲，許遠鵬，毛振敏，陳子陽，曾敏敏，李在雨

［廣州醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院（清遠市人民醫(yī)院）神經外科，廣東 清遠511518］

MicroRNA?29b調控膠質瘤發(fā)生的機制研究

侯文仲，許遠鵬，毛振敏，陳子陽，曾敏敏，李在雨

［廣州醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院（清遠市人民醫(yī)院）神經外科，廣東 清遠511518］

目的：探討microRNA?29b調控膠質瘤發(fā)生的機制.方法：利用realtime?PCR檢測不同來源的膠質瘤組織和膠質瘤細胞中miR?29b的表達，MTT檢測miR?29b對膠質瘤細胞增殖的影響；流式細胞術檢測miR?29b對膠質瘤細胞增殖周期的影響；Western blot檢測 miR?29b對細胞周期調控蛋白cyclin D1和cyclin E表達的影響.結果：MiR?29b在膠質瘤中低表達，過表達miR?29b能夠抑制U87和U251膠質瘤細胞的增殖，miR?29b使得膠質瘤G1期細胞增多，S期細胞減少，并且抑制cyclin D1和cyclin E的表達.結論：MiR?29b能夠抑制膠質瘤細胞的增殖，調控膠質瘤細胞的細胞周期，是新的膠質瘤生長抑制因子.

microRNA?29b；膠質瘤；增殖；細胞周期；治療靶點

0 引言

惡性膠質瘤（malignant glioma）是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率、復發(fā)率、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特點［1］.手術、放化療均不易根治，易復發(fā)，治愈率較低，患者存活期短.目前，各國科學家為了解膠質瘤的發(fā)生發(fā)展，尋找診治手段作出了巨大努力，卻始終沒有取得突破性進展，惡性膠質瘤仍是醫(yī)學上未被攻克的一大難題［2－4］.

MicroRNA（miRNA）是一類含量豐富的非蛋白編碼（non?protein?coding）小RNA，可作為負性基因調節(jié)器，能調節(jié)多種生物進程［5］.近年來很多報道指出miRNAs調控膠質瘤的多種生物過程，包括膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡、干細胞維持以及應激抵抗性等［6］.miRNAs表達水平的改變能夠調控很多基因的表達，既包括原癌基因，也包括腫瘤抑制基因，所以miRNAs既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為原癌基因.研究發(fā)現，miR?29家族是腫瘤中重要的調控因子，miR?29b在多種腫瘤中低表達，對胃癌等腫瘤細胞的增殖和轉移起負調控的作用，說明miR?29與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關.目前miR?29b的研究已涉及多種腫瘤，但其與膠質瘤的相關研究國內尚未見報道.本研究旨在揭示miR?29b對膠質瘤發(fā)生發(fā)展的調控及其作用機制.

1 材料和方法

1.1 主要試劑MTT試劑盒為日本Dojindo公司產品.碘化丙啶（propidium iodide，PI）和兔抗人cyclin D1／cyclin E多克隆抗體購自美國 Milipore公司.兔抗人β?actin抗體購自美國Proteintech公司.十二烷基硫酸鈉、30%聚丙烯酰胺、甘氨酸、四甲基乙二胺和過硫酸銨等均購自美國Sigma公司.聚偏二氟乙烯polyvinylidene difluoride，PVDF）膜購自上海麗臣生物科技有限公司.TRIzol試劑、反轉錄試劑盒（天根生化）.熒光定量試劑盒（北京閱微基因）.miR?29b的引物（天根生化），U6的引物（天根生化）.miR?29b的莖環(huán)引物：5'?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG?GTATTCGCACTGGATACGACAA?3'；上 游 引 物：5'?GCGC GCTAGCACCATTTG?3'；下游 引 物：5'?CAGTGCAGGGTCCGAGGT?3'.U6的反轉錄引物：5'?AACGCTTCACGAATTTGCGT?3'； 上 游 引 物： 5'?CTCGCTTCGGCAGCACA?3'；下游引物：5'?CTCGCT?TCGGCAGCACA?3'.

1.2 膠質瘤組織來源與細胞培養(yǎng)膠質瘤組織來源于廣州醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院2010～2015年膠質瘤手術切除膠質瘤標本.納入標準：診斷經病理學檢查證實；手術患者術前未行化療或放療.所有標本獲取均經過倫理委員會審核批準.人神經膠質瘤細胞系U251MG和U87MG購自中國科學院細胞庫，細胞系真實性均經過短串聯(lián)重復序列驗證.所有細胞均用高糖DMEM（Invitrogen公司，美國），添加10%的胎牛血清（GIBCO公司，美國）、100 U／mL的青霉素（NCPC公司，中國）和100 μg／mL的鏈霉素（NCPC公司，中國），培養(yǎng)環(huán)境為含5%二氧化碳的37°C細胞培養(yǎng)箱.

1.3 RNA提取用1 mL TRIzol的裂解50～100 mg臨床組織標本；冰上用勻漿器反復研磨50次左右，待組織標本研磨至無明顯結塊后轉移到預先標記好的1.5 mL離心管中；向組織勻漿中加入合適體積的氯仿（TRIzol∶氯仿＝5∶1），混勻后室溫靜置5 min，12000 r／min離心20 min；離心后水相和有機相發(fā)生明顯分層，小心將上層水相吸出，轉移到新的1.5 mL離心管中，加入與水相等體積的異丙醇，劇烈震蕩混勻，靜置 10 min；然后，4℃、12000 r／min低溫離心15 min.離心管底可見少量 RNA沉淀；小心移取上清，加1 mL左右的750 mL／L的乙醇，12000 r／min離心15 min；倒掉上清，將離心管倒置酒精完全揮發(fā)，用20 μL DEPC水溶解RNA，震蕩混勻溶解產物；將溶解的RNA進行適當的稀釋（按1∶10），并用分光光度計進行定量.

1.4 轉染將細胞接種于含有 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃常規(guī)傳代培養(yǎng).細胞采用脂質體法轉染，按說明書進行操作，將脂質體和mimic混合后無血清條件下孵育細胞，8 h后換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng).

1.5 qRT?PCR通過實時熒光定量 PCR（qRT?PCR）檢測miR?29b在神經膠質瘤細胞、神經膠質瘤組織和創(chuàng)傷性腦損傷組織中的表達水平.按照試劑盒操作規(guī)程使用Trizol從凍存的組織樣品和細胞中抽提總RNA.RNA用不含RNase的DNase處理（羅氏公司，瑞士）.然后使用反轉錄試劑盒合成cDNA.熒光定量PCR使用iQ5實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio?Rad公司）檢測信號.

1.6 MTT實驗將1×104個細胞重懸在200 μL培養(yǎng)基中種到96孔板中.處理后，培養(yǎng)基換成200 μL含0.5 mg／mL MTT的DMEM／FBS，37°C孵育4 h.棄掉上清，細胞用200 μL DMSO 37°C裂解10 min.測量490 nm處的OD值（SpectraMax公司，美國）.

1.7 細胞周期分析收集各組細胞約2×106個，PBS洗滌2次，棄上清液，緩慢向細胞沉淀中滴加1 mL預冷的70%冰乙醇，4℃固定過夜，離心，去上清液，PBS洗滌2次，0.5 mL重懸細胞，加入RNAase 200 μL，37℃ 水浴30 min，離心去上清，加入5 mg／mL的碘化丙啶1 mL，4℃ 避光染色30 min，流式細胞儀檢測.

1.8 Western blotWestern blot實驗步驟根據BM Chemiluminescence Western Blotting Kit操作說明進行.制好的蛋白樣品，先沸水浴煮5 min，煮完后冰上快速冷卻后離心5 min（12 000 r／min），然后上樣.將膠上的蛋白通過電轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，400 mA、100 min于冰浴中轉移.用10 g／L酪蛋白封閉液封閉1 h，一抗孵育過夜；第2天，用TBST洗滌PVDF膜2次，用封閉液稀釋的二抗（HRP標記的抗兔IgG／HRP標記的抗山羊IgG）孵育PVDF膜1 h（搖床100 r／min，室溫）；將PVDF膜用TBST洗滌，用X光片曝光.

1.9 統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件通過單邊非配對t檢驗對獨立樣本進行統(tǒng)計學分析.所有統(tǒng)計結果的定量分析均采用標準誤（±SEM）進行分析，并在圖中標注，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 MiR?29b在膠質瘤組織中低表達研究miR?29b在膠質瘤中的功能，首先要檢測miR?29b在膠質瘤中的表達水平，本研究收集了40例膠質瘤標本及對應的正常組織或癌旁組織.qRT?PCR檢測結果發(fā)現，miR?29b在膠質瘤組織中的表達明顯低于在正常組織和癌旁組織中的表達（圖1）.

圖1 MiR?29b在膠質瘤組織中的表達

2.2 MiR?29b抑制膠質瘤細胞增殖MiR?29b在膠質瘤組織和細胞中低表達，由此推測miR?29b可能在膠質瘤中起抑癌基因的功能.因此我們在 U87和U251檢測了miR?29b對膠質瘤細胞增殖的影響（圖2、3）.MTT實驗檢測發(fā)現，miR?29b對U87和U251的增殖起明顯的抑制作用.

圖2 MiR?29b對U87細胞增殖的影響

圖3 MiR?29b對U251細胞增殖的影響

2.3 MiR?29b對膠質瘤細胞周期的影響細胞周期實驗分析發(fā)現（圖4、5），在 U87和 U251細胞中，miR?29b組細胞在G1期所占百分率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時miR?29b組細胞在S和G2期所占百分率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）.說明miR?29b具有阻滯膠質瘤細胞由G1期進入S期的功能.

圖4 MiR?29b對U87細胞周期的影響

圖5 MiR?29b對U251細胞周期的影響

2.4 MiR?29b對細胞周期蛋白表達的影響進一步檢測G1／S關鍵調節(jié)蛋白cyclin D1和cyclin E的表達發(fā)現，在U87和U251兩種膠質瘤細胞中，miR?29b過表達能夠下調cyclin D1和cyclin E的表達（圖6）.

圖6 MiR?29b對cyclin D1和cyclin E表達的影響

3 討論

惡性膠質瘤是最常見的顱內原發(fā)性腫瘤，手術、放化療均不易根治，易復發(fā)，治愈率較低，患者存活期短.目前，各國科學家為了解膠質瘤的發(fā)生發(fā)展，尋找診治手段作出了巨大努力，卻始終沒有取得突破性進展，惡性膠質瘤仍是醫(yī)學上未被攻克的一大難題.因此，尋找新的膠質瘤治療靶標變得越來越迫切.

microRNA是一類含量豐富的非蛋白編碼（non?protein?coding）小RNA，可作為負性基因調節(jié)器，能調節(jié)多種生物進程.多種人體癌癥被證明與miRNA的突變或錯誤表達有關.microRNA可以通過靶向目標基因的3'UTR區(qū)在轉錄后水平抑制基因的表達［7］.多種人體癌癥被證明與miRNA的突變或錯誤表達有關.如卵巢癌、肺癌、肝癌、結腸癌和 GBM 等［8?14］.microRNA的下調已經成為一個新的惡性腫瘤的特征，所以一些特定的microRNA具有成為腫瘤診斷和預后的生物標志物［15］.

MiR?29家族由兩個 cluster編碼：miR?29a／miR?29b?1 cluster和miR?29c／miR?29b?2 cluster，分別定位于1q32.3及1q32.2.其家族的三個成員：miR?29a、miR?29b、miR?29c，序列高度相似，推測其功能也類似.研究證實，miR?29在肝癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤中都不同程度地表達下調，并且參與了結腸癌由腺瘤向結腸癌發(fā)展的早期過程［16］，提示其可能作為抑癌因子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［17－20］.本研究發(fā)現miR?29b在膠質瘤中低表達，并抑制膠質瘤細胞的增殖.MiR?29b調控膠質瘤的細胞周期，使得膠質瘤細胞停留在G1的細胞顯著增多，并下調細胞周期關鍵調節(jié)蛋白cyclin D1和 cyclin E的表達.這些研究證明miR?29b可以通過細胞周期阻滯抑制膠質瘤的增殖和生長，使miR?29b成為未來治療膠質瘤的潛在靶點.

［1］Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008［J］.Int J Cancer，2010，127（12）：2893－2917.

［2］Furnari FB，Fenton T，Bachoo RM，et al.Malignant astrocytic glioma：genetics，biology，and paths to treatment［J］.Genes Dev，2007，21（21）：2683－2710.

［3］Reitman ZJ，Yan H.Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in cancer：alterations at a crossroads ofcellular metabolism［J］.J Natl Cancer Inst，2010，102（13）：932－941.

［4］Wolffe AP，Matzke MA.Epigenetics：regulation through repression［J］.Science，1999，286（5439）：481－486.

［5］Park K，Lee S，Kang E，et al.New generation of multifunctional nanoparticles for cancer imaging andtherapy［J］.Adv Funct Mater，2009，19（10）：1553－1566.

［6］Schroeder A，Heller DA，Winslow MM，et al.Treating metastatic cancer with nanotechnology［J］.Nat Rev Cancer，2011，12（1）：39－50.

［7］Ambros V.microRNAs：tiny regulators with great potential［J］.Cell，2001，107（7）：823－826.

［8］Nam EJ，Yoon H，Kim SW，et al.MicroRNA expression profiles in serous ovarian carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2008，14（9）：2690－2695.

［9］Zhu D，Chen H，Yang X，et al.Decreased microRNA?224 and its clinical significance in non?small cell lung cancer patients［J］.Diagn Pathol，2014，9：198.

［10］Yang Y，Meng H，Peng Q，et al.Downregulation of microRNA?21 expression restrains non?small cell lung cancer cell proliferation and migration through upregulation of programmed cell death 4［J］.Cancer Gene Ther，2015，22（1）：23－29.

［11］Yang N，Ekanem NR，Sakyi CA，et al.Hepatocellular carcinoma and microRNA：new perspectives on therapeutics and diagnostics［J］.Adv Drug Deliv Rev，2015，81：62－74.

［12］Chen P，Wang BL，Pan BS，et al.MiR?1297 regulates the growth，migration and invasion of colorectalcancer cells by targeting cyclo?ox?ygenase?2［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（21）：9185－9190.

［13］Zhou MK，Liu XJ，Zhao ZG，et al.MicroRNA?100 functions as a tumor suppressor by inhibiting Lgr5 expression in colon cancer cells［J］.Mol Med Rep，2015，11（4）：2947－2952.

［14］Turner JD，Williamson R，Almefty KK，et al.The many roles of mi?croRNAs in brain tumor biology［J］.Neurosurg Focus，2010，28（1）：E3.

［15］Yu SL，Chen HY，Chang GC，et al.MicroRNA signature predicts survival and relapse in lung cancer［J］.Cancer Cell，2008，13（1）：48－57.

［16］劉寶瑞，謝 麗.miRNA：新一代腫瘤生物標志［J］.臨床腫瘤學雜志，2010，15（1）：1－5.

［17］Wilting SM，van Boerdonk RA，Henken FE，et al.Methylation?me?diated silencing and tumour suppressive function of hsa?miR?124 in cervical cancer［J］.Mol Cancer，2010，9：167.

［18］Pang RT，Leung CO，Ye TM，et al.MicroRNA?34a suppresses inva?sion through downregulation of Notch1 and Jagged1 in cervical carci?noma and choriocarcinoma cells［J］.Carcinogenesis，2010，31（6）：1037－1044.

［19］Flavin R，Smyth P，Barrett C，et al.miR?29b expression is associated with disease?free survival in patients with ovarian serous carcinoma［J］.Int J Gynecol Cancer，2009，19（4）：641－647.

［20］Cortez MA，Nicoloso MS，Shimizu M，et al.miR?29b and miR?125a regulate podoplanin and suppress invasion in glioblastoma［J］.Genes Chromosomes Cancer，2010，49（11）：981－990.

Study on the expression and function of microRNA?29b in human glioma

HOU Wen?Zhong，XU Yuan?Peng，MAO Zhen?Min，CHEN Zi?Yang，ZENG Min?Min，LI Zai?Yu
Department of Neurosurgery， the Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University（Qingyuan People's Hospital），Qingyuan 511518，China

AIM：To study the function and regulation mecha?nism of miRNA?29b in hunman glioma.METHODS：Realtime PCR was used to detect miR?29b expression in glioma tissues，and MTT was used to detect the influence of miR?29b on glioma cell proliferation.Flow cytometry was used to detect the influence of miR?29b on cell cycle；Western blot was used to detect the influence of miR?29b on the expression of cyclin D1 and cyclin E.RESULTS：MiR?29b was low expression in glioma tissues，and overexpression of miR?29b could inhibit the proliferation of U87 and U251 glioma cells.miR?29b can increase the number of G1 phase cells and reduce the number of S phase cells，and inhibit the expression of cyclin D1 and cyclin E.CONCLUSION：MiR?29b can regulate glioma cell cycle，inhibit the proliferation of gli?oma cells，and miR?29b may be a tumor suppressor gene in human glioma.

microRNA?29b；glioma；proliferation；cell cycle；therapy target

R739.41

A

2095?6894（2017）07?44?04

2017－05－15；接受日期：2017－05－30

清遠市科技計劃項目（2016B025）

侯文仲.博士.E?mail：harzard＠sina.com