王 震，劉 楠，劉 輝，張鵬幸，涂艷陽

（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實(shí)驗(yàn)外科，陜西西安710038）

MicroRNA?138在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其功能研究

王 震，劉 楠，劉 輝，張鵬幸，涂艷陽

（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實(shí)驗(yàn)外科，陜西西安710038）

目的：探討microRNA?138（miR?138）調(diào)控膠質(zhì)瘤增殖和遷移能力的機(jī)制.方法：利用膠質(zhì)瘤病例分析miR?138與膠質(zhì)瘤臨床病理之間的關(guān)系；利用realtime?PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251中miR?138的表達(dá)；MTT檢測(cè)miR?138對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR?138對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響；Western blot檢測(cè)miR?138對(duì)hTERT蛋白表達(dá)的影響.結(jié)果：MiR?138的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤臨床病理密切相關(guān)，膠質(zhì)瘤患者普遍呈現(xiàn)miR?138低表達(dá)現(xiàn)象，miR?138在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251中的表達(dá)低于正常膠質(zhì)細(xì)胞HEB.過表達(dá)miR?138抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251的增殖和遷移能力，同時(shí)miR?138能夠下調(diào)hTERT蛋白的表達(dá).結(jié)論：MiR?138通過下調(diào)hTERT蛋白的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，是新的膠質(zhì)瘤抑癌因子.

MicroRNA?138；膠質(zhì)瘤；增殖；遷移；hTERT

0 引言

惡性膠質(zhì)瘤是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特點(diǎn)［1］.手術(shù)、放化療均不易根治，易復(fù)發(fā)，治愈率較低，患者存活期短.目前，各國科學(xué)家為了解膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，尋找診治手段付出了巨大努力，卻始終沒有取得突破性進(jìn)展，惡性膠質(zhì)瘤仍是醫(yī)學(xué)上未被攻克的一大難題［2－4］.

MicroRNA（miRNA）是一類含量豐富的非蛋白編碼（non?protein?coding）小RNA，可作為負(fù)性基因調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)多種生物進(jìn)程.近年來很多報(bào)道指出miRNAs調(diào)控膠質(zhì)瘤的多種生物過程，包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡、干細(xì)胞維持以及應(yīng)激抵抗性等［5］.miRNAs表達(dá)水平的改變能夠調(diào)控很多基因的表達(dá)，既包括原癌基因，也包括腫瘤抑制基因，所以miRNAs既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為原癌基因［6］.miR?138家族是腫瘤中重要的調(diào)控因子，miR?138在多種腫瘤中低表達(dá)，對(duì)胃癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移起負(fù)調(diào)控的作用［21］，miR?138還可以抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的侵襲性并促進(jìn)其凋亡［18］，說明miR?138與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).因此miR?138是腫瘤發(fā)生過程中重要的調(diào)控因子.目前miR?138的研究已涉及多種腫瘤，但其與膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究國內(nèi)尚未見報(bào)道.本研究旨在揭示miR?138對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控及其作用機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 主要試劑兔抗人hTERT多克隆抗體（Santa Cruz公司），多聚賴氨酸（Sigma公司），SP免疫組化試劑盒（北京中杉公司），miRNA抽提試劑盒（TaKa?Ra公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），RT試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），iQ5實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio?Rad公司），DU 800型紫外分光光度計(jì)（Beckman公司）.

1.2 病例來源收集第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院2010～2015年膠質(zhì)瘤手術(shù)切除的85例標(biāo)本.納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)；手術(shù)患者術(shù)前未行化療或放療.所有標(biāo)本獲取均經(jīng)過倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn).

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系HEB、U251MG和U87MG購自中國科學(xué)院細(xì)胞細(xì)胞庫，細(xì)胞系真實(shí)性均經(jīng)過短串聯(lián)重復(fù)序列驗(yàn)證.所有細(xì)胞均用高糖DMEM（Invitrogen公司，美國），添加10%的胎牛血清（GIBCO公司，美國）、100 U／mL的青霉素（NCPC公司，中國）和100 μg／mL的鏈霉素（NCPC公司，中國），培養(yǎng)環(huán)境為含5%二氧化碳的37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱.

1.4 RNA提取用1 mL TRIzol裂解50～100 mg臨床組織標(biāo)本；冰上用勻漿器反復(fù)研磨50次左右，待組織標(biāo)本研磨至無明顯結(jié)塊后轉(zhuǎn)移到預(yù)先標(biāo)記好的1.5 mL離心管中；向組織勻漿中加入合適體積的氯仿（TRIzol∶氯仿＝5∶1），混勻后室溫靜置 5 min，12 000 r／min離心20 min；離心后水相和有機(jī)相發(fā)生明顯分層，小心將上層水相吸出，轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，加入與水相等體積的異丙醇，劇烈震蕩混勻，靜置10 min；然后，4℃、12 000 r／min低溫離心15 min.離心管底可見少量RNA沉淀；小心移取上清，加1 mL左右的750 mL／L的乙醇，12 000 r／min離心15 min；倒掉上清，將離心管倒置酒精完全揮發(fā)，用20 μL DEPC水溶解RNA，震蕩混勻溶解產(chǎn)物；將溶解的RNA進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專ò?∶10），并用分光光度計(jì)進(jìn)行定量.

1.5 轉(zhuǎn)染將細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃常規(guī)傳代培養(yǎng).細(xì)胞采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，按說明書進(jìn)行操作，將脂質(zhì)體和miR?138 mimics（GCCGGACUAAGUGUUGUGGUCGA）混合后無血清條件下孵育細(xì)胞，8 h后換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng).

1.6 qRT?PCR通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT?PCR）檢測(cè)miR?138在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和創(chuàng)傷性腦損傷組織中的表達(dá)水平.按照試劑盒操作規(guī)程使用Trizol（Invitrogen公司，美國）從凍存的組織樣品和細(xì)胞中抽提總RNA.RNA用不含RNase的DNase處理（羅氏公司，瑞士）.然后使用B caBest RNA PCR試劑盒（TAKAR公司，中國）來合成cDNA.所有引物均由上海生工生物科技有限公司合成，熒光定量PCR使用SYBR底物，用iQ5實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio?Rad公司）檢測(cè)信號(hào).PCR引物序列為：miR?138?RT：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA?TTCAGTTGAGCGGCCTGAT，U6?RT：CGCTTCACGA?ATTTGCGTGTCAT，U6?F：CTC?GCTTCGGCAGCACA，U6?RAACGCTTCACGAATTTGCGT，miR?138?F：ACAC?TCCAGCTGGGAGCTGGTGTTG，GAPDH?F：ACACCC?ACTCCTCCACCTTT，GAPDH?R：TTAC?TCCTTGGAG?GCCATGT.

1.7 MTT實(shí)驗(yàn)將1×104個(gè)細(xì)胞重懸在200 μL培養(yǎng)基中，種到96孔板.處理后，培養(yǎng)基換成200 μL含0.5 mg／mL MTT的DMEM／FBS，37°C孵育4 h.棄掉上清，細(xì)胞用200 μL DMSO 37°C裂解10 min.測(cè)量490 nm處的OD值.

1.8 Western blotWestern blot實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)BM Chemiluminescence Western Blotting Kit操作說明進(jìn)行.制好的蛋白樣品，先沸水浴煮5 min，煮完后冰上快速冷卻后離心5 min（12 000 r／min），然后上樣.然后將膠上的蛋白通過電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，400 mA、100 min于冰浴中轉(zhuǎn)移.用10 g／L酪蛋白封閉液封閉1 h，一抗4℃冰箱孵育過夜（8 h）；一抗孵育完后，用TBST洗滌PVDF膜2次，用封閉液稀釋的二抗（HRP標(biāo)記的抗兔IgG／HRP標(biāo)記的抗山羊IgG），孵育PVDF膜1 h（搖床100 r／min，室溫）；將PVDF膜用TBST洗滌，用X光片曝光.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SPSS公司，美國）通過單邊非配對(duì) t檢驗(yàn)對(duì)獨(dú)立樣本進(jìn)行分析.所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果的定量分析均采用標(biāo)準(zhǔn)誤（±SEM）進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 MiR?138與膠質(zhì)瘤臨床病理關(guān)系以85例膠質(zhì)瘤患者miR?138相對(duì)表達(dá)量的平均值1.68為界，將85例病例進(jìn)行臨床病理分析分為miR?138低表達(dá)組和miR?138高表達(dá)組.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各級(jí)別的膠質(zhì)瘤患者中，miR?138低表達(dá)患者明顯多于高表達(dá)患者，并且性別、年齡因素對(duì)miR?138的表達(dá)無顯著影響（表1）.

表1 85例膠質(zhì)瘤患者miR?138的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 ［n（%）］

2.2 MiR?138在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá)明確了miR?138的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系之后，需要進(jìn)一步檢測(cè)miR?138在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，因此本研究選取正常人腦膠質(zhì)細(xì)胞株HEB和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和U87作為對(duì)象檢測(cè)分析miR?138在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR?138在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251中的表達(dá)水平明顯低于HEB膠質(zhì)細(xì)胞（圖1），該結(jié)果進(jìn)一步證明miR?138在膠質(zhì)瘤中是低表達(dá)的.

圖1 MiR?138在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 MiR?138過表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖MiR?138在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)，由此推測(cè)miR?138可能在膠質(zhì)瘤中具有抑癌基因的功能.因此本研究在 U87和 U251中轉(zhuǎn)染 miR?138 mimics過表達(dá)miR?138，并觀察miR?138對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR?138過表達(dá)對(duì)U87（圖2）和U251（圖3）的增殖均起明顯的抑制作用.

圖2 MiR?138對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響

圖3 MiR?138對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

2.4 MiR?138影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移除了增殖實(shí)驗(yàn)，本研究進(jìn)一步用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR?138對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，劃痕形成24 h后，miR?138過表達(dá)后的U87和U251細(xì)胞的遷移速度明顯減慢，即miR?138對(duì)U87和U251細(xì)胞的遷移起抑制作用（圖4）.

圖4 MiR?138對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

2.5 MiR?138對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響研究表明，在胃癌中，miR?138可以下調(diào)hTERT蛋白，并且hTERT蛋白被證明與胃癌的發(fā)生及惡性程度相關(guān).因此本研究檢測(cè)了在膠質(zhì)瘤中miR?138對(duì)hTERT蛋白表達(dá)的影響.結(jié)果顯示，在U87和U251兩種細(xì)胞中，相對(duì)于正常U87和U251細(xì)胞以及陰性對(duì)照細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR?138后hTERT蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（圖5），表明在膠質(zhì)瘤中miR?138可能通過調(diào)控hTERT蛋白的表達(dá)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移.

圖5 MiR?138對(duì)hTERT表達(dá)的影響

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的、預(yù)后較差的原發(fā)性惡性腫瘤.由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤呈侵潤性生長，與腦組織無明顯分界，難以做到全部切除，僅通過傳統(tǒng)手術(shù)無法有效治愈，多主張聯(lián)合治療，配以化療和放療延緩復(fù)發(fā)和延長生存期.即使給予傳統(tǒng)的手術(shù)聯(lián)合放、化療的綜合治療方法，低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的平均存活時(shí)間僅為3～5年，而高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的平均存活時(shí)間為1～2年.因此，尋找新的治療靶點(diǎn)一直是膠質(zhì)瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).

MicroRNA是一種內(nèi)源性的單鏈小 RNA（19～25 nt）［7］，無開放閱讀框.作為非編碼的核苷酸，microRNA在許多重要的生命活動(dòng)過程和疾病中起至關(guān)重要的作用［8］.miRNA通過與3'非翻譯區(qū)配對(duì)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)［9］.microRNA參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及其他重要的生命活動(dòng)，而上述功能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［10］.例如，miR?21，miR?7，mir?128和miR?221／22與膠質(zhì)瘤的惡性發(fā)展［11－12］.有研究［13－17］表明，miR?101在患者腫瘤樣本和細(xì)胞系中表達(dá)顯著下調(diào)，例如肺癌、乳腺癌、喉鱗狀細(xì)胞癌、胚胎性橫紋肌肉瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤.miR?138還可以抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的侵襲性并促進(jìn)其凋亡，通過下調(diào)P?糖蛋白、bcl?2、多藥耐藥基因1等逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的白血病細(xì)胞.其他研究［18］結(jié)果也提示，miR?138可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長，在腫瘤發(fā)生中起重要調(diào)控作用.鑒于miR?138在膠質(zhì)瘤中的功能報(bào)道較少，因此研究miR?138對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生的影響及調(diào)控機(jī)理具有十分重要的意義.

已有研究表明，hTERT不但在腫瘤的發(fā)生、生長中起重要作用［19］，最近還被證實(shí)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移能力，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［20］.hTERT可能是miR?138的下游靶基因，在胃癌中，miR?138可以下調(diào)hTERT蛋白，并且hTERT蛋白被證明與胃癌發(fā)生及惡性相關(guān)［21］.因此本研究檢測(cè)了在膠質(zhì)瘤中 miR?138對(duì)hTERT蛋白表達(dá)的影響.研究［21］表明，miR?138在轉(zhuǎn)錄后水平抑制 hTERT翻譯，miR?138表達(dá)水平與hTERT的表達(dá)成反比.本研究發(fā)現(xiàn)，miR?138與膠質(zhì)瘤臨床病理關(guān)系密切相關(guān)，在各級(jí)別的膠質(zhì)瘤患者中，miR?138低表達(dá)患者明顯多于高表達(dá)患者，且miR?138在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào).過表達(dá)miR?138能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，證明miR?138在膠質(zhì)瘤中起到抑癌基因的功能.同時(shí)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251中，miR?138能夠顯著下調(diào)hTERT的表達(dá)，說明miR?138可能是通過下調(diào)hTERT蛋白的表達(dá)起到抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用.綜上所述，miR?138是一個(gè)新的膠質(zhì)瘤抑癌因子，未來可能成為膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn).

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A study of the expression and function of microRNA?138 in human glioma

WANG Zhen，LIU Nan，LIU Hui，ZHANG Peng?Xing，TU Yan?Yang
Department of Experimental Surgery，Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an 710038，China

AIM：To study the mechanism of miRNA?138（miR?138）regulating glioma proliferation and migration.METHODS：The relationship between miR?138 and glioma was analyzed.Real?time?PCR was uaed to detect the expression of miR?138 in U87 and U251 glioma cells；MTT was used to detect the effect of miR?138 on glioma cell proliferation；Would healing was used to detect the influence of miR?138 on glioma cell migration；Western blot was used to test the effect of miR?138 on hTERT protein expres?sion.RESULTS：The expression of miR?138 was closely related to the clinical pathology，and glioma patients exhibited miR?138 low expression phenomenon.MiR?138 was lower expression in U87 and U251 glioma cells compared with normal glial cell HEB.MiR?138 inhibited U87 and U251 cell proliferation and migration.At the same time，miR?138 overexpression inhibited the expres?sion of hTERT.CONCLUSION：MiR?138 inhibits glioma cell proliferation and migration through down?regulating the expression of hTERT protein，it may be a new glioma tumor suppression factor.

microRNA?138；glioma；proliferation；migration；hTERT

R739.41

A

2095?6894（2017）07?48?04

2017－04－29；接受日期：2017－05－13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81572983）

王 震.碩士.E?mail：wzh?2010＠163.com

涂艷陽.博士，副教授，副主任醫(yī)師.E?mail：tu.fmmu＠gmail.com