李東寶 李德春 趙華 趙鑫

·論著·

穩(wěn)定過表達hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1細胞株的構建

李東寶 李德春 趙華 趙鑫

目的 構建穩(wěn)定過表達hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1細胞株，為研究hB7-H3基因的功能提供基礎工具。方法 將hB7-H3基因片段插入攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒質(zhì)粒GV287，構建重組hB7-H3-GV287質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達，蛋白質(zhì)印跡法檢測hB7-H3蛋白表達；通過慢病毒包裝后測定病毒滴度。將表達hB7-H3的病毒感染人胰腺癌PANC1細胞，應用流式細胞儀檢測GFP及hB7-H3陽性表達率；實時PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測感染細胞的hB7-H3 mRNA及蛋白表達。以自身環(huán)化的GV287質(zhì)粒作為陰性對照(NC)。結果 重組質(zhì)粒的PCR擴增片段約1 368 bp，NC質(zhì)粒無擴增產(chǎn)物，重組質(zhì)粒DNA測序結果與設計的片段完全一致，表明重組hB7-H3-GV287質(zhì)粒構建成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后293T細胞表達hB7-H3蛋白，而NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞無hB7-H3蛋白表達。重組hB7-H3質(zhì)粒經(jīng)慢病毒包裝后的病毒滴度為2×108TU/ml。慢病毒感染人胰腺癌PANC1細胞后，細胞hB7-H3陽性表達率、hB7-H3 mRNA及蛋白表達分別為94.3%、5.09±0.24、2.85±0.27，較NC慢病毒感染的18.5%、1.28±0.53、0.44±0.69顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。結論 穩(wěn)定過表達hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1細胞株的構建成功。

胰腺腫瘤； 慢病毒感染； 基因表達； 細胞系，腫瘤； hB7-H3

【Fund program】 National National Science Foundation of China(81302146); Postdoctoral Science Foundation Grant of China(2016M591913); Natural Science Foundation of Jiangsu Province(BK20161225); Scientific Research Program of Jiangsu Provincial Commission of Health and Family Planning(H201620); Science and Technology Program of Suzhou City(SYS201539); Jiangsu Province Youth Medical Talent Project(QNRC2016732); Six Talent Peak Project in Jiangsu Province(2016-WSW-043)

人B7-H3(hB7 homology 3，hB7-H3)屬于B7共刺激分子家族的成員之一，最早由Chapoval等[1]從人樹突狀細胞(DC)來源的cDNA文庫中克隆而來。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，hB7-H3作為免疫共刺激分子，在T細胞等免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[2]。hB7-H3在多種人類惡性腫瘤中高表達，如乳腺癌、腎癌、前列腺癌、小細胞肺癌、胰腺癌等，且與患者的預后呈負相關性[3-6]。Zhao等[7]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)人胰腺癌PaTu8988細胞hB7-H3表達可促進腫瘤細胞凋亡，增加癌細胞對化療藥吉西他濱的敏感性。因此，hB7-H3作為一個潛在的“免疫卡控點”，對胰腺癌等惡性腫瘤的治療具有重大意義[8]。本研究構建穩(wěn)定高表達hB7-H3的人胰腺癌PANC1細胞株，為后續(xù)研究提供實驗基礎。

材料與方法

一、重組hB7-H3-GV287表達載體的構建

根據(jù)GenBank庫人hB7-H3(CD276)基因序列(NM_001024736)設計hB7-H3基因引物，上、下游分別帶有BamHI、AgeI酶切位點。上游序列為5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGCTGCG-TCGGCGGGGCA-3′；下游序列為5′-TCCTTGTAGTCCATACCGGCTATTTCTTGTCCATCATC-3′，由金唯智生物科技有限公司(蘇州，中國)合成。PCR反應條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2 min，30次循環(huán)，72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后采用DNA回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收，應用雙酶切獲得hB7-H3基因片段。攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的環(huán)狀GV287慢病毒質(zhì)粒載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司，應用BamHI、AgeI雙酶切獲得線性化GV287載體。線性化目的基因片段及線性化GV287載體通過In-fusion交換酶(美國Clontech公司)置25℃ 30 min、42℃ 15 min進行連接，獲得表達hB7-H3的重組質(zhì)粒。以插入GAPDH片段質(zhì)粒作為陽性對照，以自身環(huán)化質(zhì)粒作為陰性對照。將3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α大腸桿菌，接種到含AMP 100 μg/ml的LB瓊脂糖培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，取單菌落進行PCR檢測鑒定。PCR引物上游序列5′-TGGCACAGGGCAACGCATC-3′，下游序列5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。PCR反應條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，30次循環(huán)，72℃ 5 min后置4℃保存。并將陽性菌送上海吉凱基因化學技術有限公司進行測序。

二、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后293T細胞hB7-H3表達檢測

取對數(shù)生長期293T細胞，接種24孔板培養(yǎng)過夜。采用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)將重組質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒、陽性對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞，按試劑使用說明書操作。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP陽性細胞，轉(zhuǎn)染36 h后收集細胞，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測293T細胞hB7-H3蛋白表達。鼠抗人一抗購自Sigma公司、羊抗鼠二抗購于Santa-Cruz公司，抗體滴度參照說明書。最后采用ECL發(fā)光，X光片曝光、顯影、定影。以WB標準品SURVIVIN-3FLAG-GFP (分子質(zhì)量48 000)作為陽性對照行蛋白電泳觀察。

三、慢病毒顆粒包裝和滴度測定

取對數(shù)生長期的293T細胞，以1.2×107個細胞數(shù)接種于15 cm細胞培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用Qiagen公司提供的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提重組質(zhì)粒、載體質(zhì)粒pHelper1.0及pHelper2.0的DNA，取10 μg DNA與相應容積的Opti-MEM混均，采用Lipofectamine 2000將3種質(zhì)粒DNA共同轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)48 h后收集細胞培養(yǎng)上清液，離心去細胞碎片，超濾濃縮，獲取病毒原液，分裝，置-80℃保存。于96孔板每孔接種4×104個293T細胞，取病毒原液，以倍比稀釋法加入各孔細胞的培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)4 d，觀察熒光蛋白表達并拍照，計算熒光細胞數(shù)，除以稀釋倍數(shù)，得出病毒原液的滴度，單位為TU/ml。

四、穩(wěn)定過表達hB7-H3(hB7-H3+)的PANC1細胞株建立

PANC1細胞株購自上海吉凱基因化學技術有限公司。取對數(shù)生長期細胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，以5×104個細胞接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，加入108TU/ml病毒4 μl(MOI 1∶20)感染細胞12 h，棄培養(yǎng)液，加入2 ml含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，感染后4 d觀察熒光細胞數(shù)并拍照，上流式細胞儀檢測病毒感染率(hB7-H3+組)。再經(jīng)sorting流式細胞儀分選陽轉(zhuǎn)細胞后，用流式細胞儀檢測GFP陽性表達率。同法以陰性對照質(zhì)粒感染PANC1細胞作為陰性對照組(NC組)。

五、PANC1細胞hB7-H3表達陽性率檢測

取對照組(親本細胞)、NC組、hB7-H3+組PANC1細胞，PBS洗滌后制成單細胞懸液，計數(shù)，每管加入3×105個細胞(3 ml)，每組2管。1管加入2 μl PE標記的抗hB7-H3抗體(美國Invitrogen公司)，輕輕混勻，4℃反應10 min，另1管不加抗體作為對照，上流式細胞儀檢測hB7-H3陽性表達細胞的百分率。實驗重復3次，取均值。

六、PANC1細胞hB7-H3 mRNA表達水平檢測

分別取上述3組PANC1細胞，采用Trizol提取各組細胞的總RNA， 實時 PCR SYBR GREEN法檢測細胞hB7-H3 mRNA表達。hB7-H3上游引物序列為5′-CTCTGCCTTCTCACCTCTTTG-3′；下游引物序列為5′-CCTTGAGGGAGGAACTTTATC-3′，擴增片段134 bp。內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；下游引物序列為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴增片段121 bp。PCR反應條件：94℃ 5 min，94℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，40次循環(huán)。以儀器自帶軟件獲得相應的Ct值，以對照組細胞為基準，采用公式 2-△△Ct計算hB7-H3 mRNA相對表達量。

七、PANC1細胞hB7-H3蛋白表達水平檢測

分別取上述3組細胞， 裂解液提取細胞總蛋白， BCA法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測hB7-H3蛋白表達，以GAPDH為內(nèi)參。最后ECL發(fā)光，X光片曝光、顯影、定影。通過灰度分析軟件半定量hB7-H3蛋白表達量。

八、統(tǒng)計學處理

結 果

一、重組hB7-H3-GV287表達載體的構建及鑒定

設計引物的PCR擴增片段大小約為1 646 bp，與預期相符(圖1)。重組質(zhì)粒的PCR擴增片段約1 368 bp，陽性對照質(zhì)粒擴增出相應片段，陰性對照質(zhì)粒無擴增產(chǎn)物 (圖2)。DNA測序分析結果顯示重組質(zhì)粒的編碼序列與設計的片段完全一致(圖3)，表明重組hB7-H3-GV287表達載體構建成功。

二、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后293T細胞hB7-H3蛋白表達

293T細胞不表達hB7-H3蛋白，但重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后283T細胞表達hB7-H3蛋白(圖4)。

1：Marker；2：B7-H3 圖1 引物擴增產(chǎn)物的電泳圖

圖2 空白對照(1)、陰性對照(2)、陽性對照(3)、重組質(zhì)粒(5～12)擴增產(chǎn)物電泳圖

圖3 陽性克隆hB7-H3基因測序圖

圖4 標準品(1)、293T細胞(2)、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞(3)hB7-H3蛋白表達

三、病毒包裝及滴度測定

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞24 h后，細胞內(nèi)可見明顯熒光(圖5)。慢病毒原液滴度為2×108TU/ml。

圖5 重組質(zhì)粒(5A)、陰性對照質(zhì)粒(5B)慢病毒轉(zhuǎn)染的293T細胞[熒光顯微鏡(左)，光學顯微鏡(右)，×200]

四、hB7-H3+的PANC1細胞株建立及鑒定

對照組、NC組、hB7-H3+組PANC1細胞GFP陽性率分別為 0、99.2%、95.0%(圖6)；細胞膜hB7-H3表達率分別為15.4%、18.5%、94.3%(圖7)；hB7-H3 mRNA表達量分別為1.19±0.78、1.28±0.53、5.09±0.24，蛋白表達量為0.37±0.18、0.44±0.69、2.85±0.27(圖8)。hB7-H3+組PANC1細胞的hB7-H3 mRNA及蛋白表達量顯著高于NC組及對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為20.45、21.78，P值均<0.0001)，表明穩(wěn)定過表達hB7-H3的PANC1細胞株構建成功。

圖6 對照組(6A)、NC組(6B)、hB7-H3+組(6C)PANC1細胞GFP陽性表達率

圖7 對照組(7A)、NC組(7B)、hB7-H3+組(7C)PANC1細胞膜hB7-H3 陽性表達率

圖8 對照組(1)、hB7-H3+組(2)、NC組(3)PANC1細胞hB7-H3蛋白表達

討 論

基因治療是當前研究熱門的治療手段之一?；騻鬟f系統(tǒng)是基因治療的重要組成部分，也是目前基因治療的瓶頸。現(xiàn)有的基因載體包括病毒載體和非病毒載體兩類。鄒多宏等[9]采用RT-PCR法從淋巴細胞總RNA中獲得hB7-H3基因，構建了人hB7-H3的真核表達載體pEGFP-C1-hB7-H3，并轉(zhuǎn)染到舌鱗癌細胞Tca8113。但非病毒載體存在靶向困難、轉(zhuǎn)染效率低、有效表達時間短等問題[10]。慢病毒載體是人類免疫缺陷病毒-1( HIV-1)來源的一種病毒載體，能高效地將目的基因?qū)爰毎?，且感染效率高、攜帶基因片段容量較大、目的基因在宿主細胞內(nèi)可以長時間穩(wěn)定表達[11]，因此是轉(zhuǎn)移目的基因的理想載體。目前第三代慢病毒載體是沒有完整復制功能的病毒載體，既含有標志基因如GFP，又可攜帶治療性基因[12]。

本研究采用慢病毒載體系統(tǒng)由GV287質(zhì)粒、載體質(zhì)粒pHelper1.0、包裝質(zhì)粒pHelper2.0組成。GV287質(zhì)粒又攜帶熒光標志的GFP，能通過熒光顯微鏡觀察到病毒感染狀況。本研究結果顯示，導入目的基因hB7-H3的重組hB7-H3-GV287質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后，293T細胞能有效地過表達hB7-H3蛋白。重組質(zhì)粒與載體質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞后，通過熒光顯微鏡可觀察到大量綠色熒光,說明慢病毒包裝成功，且病毒滴度高達2×108TU/ml。將表達hB7-H3的慢病毒載體感染人胰腺癌PANC1細胞，PANC1細胞的hB7-H3 mRNA及蛋白表達水平顯著增加，提示穩(wěn)定過表達hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1細胞株構建成功，為進一步研究hB7-H3的生物學功能及腫瘤的治療等方面提供了良好的實驗基礎 。

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(本文編輯：呂芳萍)

Construction of a human pancreatic cancer cell line PANC1 stably over-expressing hB7-H3 gene

Li Dongbao, Li Dechun, Zhao Hua, Zhao Xin.

Department of General Surgery, First Affiliated Hospital, Soochow University, Suzhou 215000, China

Zhao Xin, Email: zhaox@suda.edu.cn

Objective To construct the stably over-expressing hB7-H3 gene human pancreatic cancer cell line PANC1, and provide tools for further investigating the function of hB7-H3. Methods hB7-H3 gene fragment was inserted into lentiviral plasmid GV287 carrying GFP to construct recombinant hB7-H3-GV287 plasmid vector. 293T cells were transfected, and the GFP expression was evaluated under fluorescence microscopy. Western Blot wasused to detect the expression of hB7-H3 protein. Lentiviral vectors were packaged and the titer was determined. The recombinant hB7-H3 expressed lentivirus was used to infect PANC1 cell. Flow cytometry was applied to detecte the percentage of GFP and hB7-H3 positive cells. Real-time PCR and Western Blot was used to verify the mRNA and protein expression of hB7-H3. Self-cyclizing GV287 plasmid served as negative control (NC). Results PCR amplified fragment of recombinant plasmid was around 1 368 bp, and no amplified production of NC plasmid was observed. The DNA sequencing of recombinant plasmid was completely consistent with the designed fragment, indicating that hB7 H3-GV287 plasmid was successfully constructed. 293T cells transfected with recombinant plasmid expressed hB7-H3 protein, while those cells transfected with NC plasmid did not express hB7-H3 protein. The virus titer of lentiviral packaged recombinant hB7-H3 plasmid was 2×108TU/ml. The percentage of hB7-H3 positive cells, hB7-H3 mRNA and protein expression in PANC1 cells infected with cells infected with hB7-H3 lentivirus was 94.3%, 5.09±0.24 and 2.85±0.27, respectively, which was obviously higher than 18.5%, 1.28±0.53 and 0.44±0.69 in cells infected with NC lentivirus, and the differences were statistically significant (Pvalue <0.01). Conclusions A human pancreatic cancer cell line PANC1 stably over-expressing hB7-H3 was successfully constructed.

Pancreatic neoplasms; Lentiviral infections; Gene expression; Cell line, tumor; hB7-H3

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.04.007

215000 江蘇蘇州，蘇州大學附屬第一醫(yī)院普外科、胰腺疾病研究中心

趙鑫，Email: zhaox@suda.edu.cn

國家自然科學基金(81302146)；中國博士后基金(2016M591913)；江蘇省自然科學基金(BK20161225)；江蘇省衛(wèi)生計生委科研課題(H201620)；蘇州市科技計劃(SYS201539)；江蘇省青年醫(yī)學人才項目(QNRC2016732)；江蘇省“六大人才高峰”計劃資助項目(2016-WSW-043)

2016-11-14)