于士婷，趙大慶，尹翌秋，白雪媛*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130021；2.長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司，長春 130117）

利心丸中粉防己堿HPLC檢測方法的建立及其評價

于士婷1，趙大慶1，尹翌秋2，白雪媛1*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130021；2.長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司，長春 130117）

目的 建立利心丸中粉防己堿含量測定方法。方法 采用高效液相色譜法測定。色譜柱：安捷倫，ZORBAX SB-Aq（5 μm, 4.6 mm×250 mm），流動相：甲醇-乙腈-水-二乙胺（60：20：20：0.08）,檢測波長：282 nm，柱溫：25 ℃，流速：1.0 mL/min。結(jié)果 粉防己堿的線性范圍為0.309 6 ～1.857 6 μg（r =0.999 8），平均加樣回收率為98.3%（RSD=1.42%）。結(jié)論 該方法操作簡便易行，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠，可用于利心丸的質(zhì)量控制。

利心丸；粉防己堿；反相高效液相色譜法

利心丸（濃縮水丸）處方來源于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（中藥成方制劑第8冊，標(biāo)準(zhǔn)編號為WS3-B-32），由貂心、茯苓、生地黃、天冬、防己、牡丹皮、琥珀及朱砂8味中藥組成。具有補(bǔ)心安神的功效，用于風(fēng)濕性心臟病，心動過速，心律不齊，心力衰竭等而見心血不足之證者。關(guān)于利心丸質(zhì)量控制,原標(biāo)準(zhǔn)過于簡單，主要集中在丹皮酚的含量測定及對生地黃、防己和牡丹皮的TLC定性鑒別[1-6]。為了更好的控制利心丸的質(zhì)量，本文在相關(guān)文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，首次對利心丸（濃縮水丸）中的粉防己堿含量采用高效液相色譜法進(jìn)行了分析，并建立了完整的質(zhì)量檢測方法。粉防己堿是利心丸原料防己中的主要有效成分，具有抗心律失常、抗心肌缺血、抗腫瘤、降壓、抗炎等作用[7-11]。結(jié)果表明，本方法穩(wěn)定可靠、方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（安捷倫1 100 ），超聲波清洗器（江蘇省金壇市榮華儀器制造），電熱鼓風(fēng)干燥箱（PHG-9070A，上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥 粉防己堿對照品(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院,供含量測定用,純度98.41%，批號15041702)。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 樣品 利心丸（濃縮水丸）樣品為吉林特研藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號：20141201，20141202，20141203，20141204，20141205，20141206）。利心丸陰性樣品(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫，ZORBAX SB-Aq（5 μm, 4.6 mm×250 mm）；流動相：甲醇-乙腈-水-二乙胺（60:20:20:0.08）；檢測波長：282 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 mL。理論板數(shù)按粉防己堿峰計算應(yīng)不低于4 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取粉防己堿對照品10.320 mg，加甲醇溶液制成每1 mL含103.2 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取利心丸（濃縮水丸）10 g，粉碎，取粉末（過3號篩）約0.7 g，精密稱定，精密加入2%鹽酸甲醇溶液25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用2%鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，濃縮，用流動相溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取不含防己的處方，按利心丸（濃縮水丸）制備工藝制成不含防己的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性考察 精密吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各20 mL注入液相色譜儀中，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，陰性對照在粉防己堿對照品相應(yīng)的保留時間附近無干擾峰出現(xiàn)，表明本方法具有良好的專屬性。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項下的粉防己堿對照品溶液3、6、9、12、15、18 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測定。以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)作圖，計算回歸方程：Y=92.543X-1.866 7，r=0.999 8。其結(jié)果表明：粉防己堿進(jìn)樣量在0.309 6～1.857 6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 重復(fù)性試驗 取同一批次的利心丸（批號：20141201）6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在相同操作條件下，由同一分析人員在較短的間隔時間內(nèi)照“2.1”項下色譜條件進(jìn)行6次獨立測定。結(jié)果見表1。

表1 重復(fù)性試驗結(jié)果（n=6）

2.6 中間精密度試驗 取同一批利心丸（批號：20141201）6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在同一實驗室不同時間內(nèi)，由不同分析人員在不同設(shè)備上進(jìn)行6次獨立測定。測定結(jié)果表明，粉防己堿的平均含量是0.590 mg/g，RSD是1.02%（n=6），該方法中間精密度良好。

2.7 耐用性實驗

2.7.1 供試液穩(wěn)定性及儀器精密度實驗 取同一供試品溶液（批號：20141201）適量，按“2.1”項下色譜條件不同時間重復(fù)進(jìn)樣測定6次，以測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來反映測定儀器的精密度及供試液的穩(wěn)定性。結(jié)果平均值為0.580 mg/g，RSD為1.27%。由測定結(jié)果可知，供試液在8 h內(nèi)穩(wěn)定，且儀器精密度良好。

2.7.2 柱溫對測定結(jié)果的影響 精密稱取樣品粉末0.70 g，按供試品溶液制備方法制備樣品液，按選定色譜條件分別于柱溫20、25、30 ℃進(jìn)樣測定，結(jié)果表明柱溫變化對分離效果及測定結(jié)果略有影響，但差異不大。

2.8 加樣回收率試驗 取6份同批號（批號20141201，粉防己堿含量為0.59 mg/g）的樣品約0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中。分別精密加入5 mL粉防己堿對照品溶液（103.2 μg/mL），混勻后按“2.2.2”項下方法操作制備供試品溶液，測定粉防己堿含量，計算回收率。平均回收率為98.3%，RSD是1.42%（n=6）。

2.9 樣品含量測定 取5批利心丸適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2. 1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算粉防己堿的含量，結(jié)果見表2。

表2 利心丸中粉防己堿的含量測定結(jié)果（n=5）

3 討論

3.1 目標(biāo)成分的選擇 關(guān)于利心丸的質(zhì)量研究，文獻(xiàn)報道主要集中在丹皮酚的含量測定及對生地黃、防己和牡丹皮的TLC定性鑒別。本文通過系統(tǒng)的比較研究，首次建立粉防己堿的含量檢測方法。由于防己諾林堿對照品出峰時間較早，陰性對照在防己諾林堿對照品相應(yīng)的保留時間附近有干擾峰出現(xiàn)，所以本文只對防己中的粉防己堿進(jìn)行含量測定。通過對利心丸中粉防己堿的含量分析，不僅補(bǔ)充了原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并且對指導(dǎo)制劑生產(chǎn)和控制質(zhì)量具有一定的應(yīng)用價值。

3.2 提取方法的選擇 經(jīng)文獻(xiàn)[12-14]查詢，考察了不同提取方法（回流提取，超聲提取，索氏提取）及不同溶劑（2%鹽酸甲醇、甲醇、80%乙醇）對含量的影響。結(jié)果，以2%鹽酸甲醇溶液加熱回流提取的提取率最高。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法專屬性強(qiáng)，空白對照無干擾，可以作為利心丸中含量測定指標(biāo)，能夠達(dá)到控制利心丸質(zhì)量的目的。

3.3 色譜分離條件的選擇 流動相的選擇，有文獻(xiàn)報道[15-17]應(yīng)用乙腈-甲醇-水作為流動相可對防己中的粉防己堿進(jìn)行良好的分離。分別考查了乙腈-甲醇-水-冰醋酸（每100 mL含十二烷基磺酸鈉0.41 g）、乙腈-0.01%三乙胺水、甲醇-乙腈-水-二乙胺等不同流動相以及不同比例的流動相，結(jié)果表明，甲醇-乙腈-水-二乙胺為流動相分離效果好，分析圖譜的分離度、拖尾因子及對稱性等條件均達(dá)到《中華人民共和國藥典》（2015版）中的要求。

[1]王喜民, 孫文, 吳晶. 利心丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2014, 12(18): 88-89.

[2]張紹軒, 揚軍, 王學(xué)農(nóng), 等. 利心丸中牡丹皮及防己的薄層色譜鑒別[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(2): 432-433.

[3]吳楠, 張秀麗. HPLC法測定利心丸中丹皮酚的含量[J].中國藥事, 2009, 23(6): 568-569, 572.

[4]邢玉軍, 曲永梅, 徐景芝. HPLC法測定利心丸中丹皮酚的含量[J]. 吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報, 2006, 27(4): 206-207.

[5]鄂春華, 王德才. HPLC法測定利心丸中丹皮酚的含量[J].中國藥師, 2008, 11(10): 1216-1218.

[6]張紹軒, 楊軍, 陳桐, 等. 利心丸中生地黃的薄層色譜鑒別[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2008, 24(3): 265-265.

[7]王輝, 羅順德, 蔡鴻生. 粉防己堿的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2000, 35(12): 800.

[8]邢志博, 王鳳梅, 王翠平, 等. 粉防己有效成分的藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2014, 20(9): 241-246.

[9]張靜, 沈永青, 仇煒, 等. 粉防己堿誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[J]. 中國癌癥雜志, 2015, 25(12): 953-958.

[10]余良主, 石春蓉. 粉防己堿對高血壓大鼠左室心肌營養(yǎng)素-1及其受體gp130/LIFR表達(dá)的影響[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2014, 20(11): 151-155.

[11]陳悠然. 粉防己堿增強(qiáng)三氧化二砷的抗腫瘤作用并降低其心臟毒性的研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2014.

[12]鞏偉, 趙慶華, 王莉, 等. 防己薏連丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥師, 2014, 17(1): 80-84.

[13]黃澤春, 王益群. 高效液相色譜法測定防己藥材中粉防己堿與防己諾林堿的含量[J]. 中南藥學(xué), 2008, 6(5): 541-543.

[14]張淑瑜, 于燕莉, 劉世君, 等. 復(fù)方漢防己顆粒中防己的成分鑒別及含量測定[J]. 中國藥事, 2013, 27(7): 725-728.

[15]楊學(xué)猛, 徐鳳梅, 魏景文, 等. RP-HPLC測定舒肝飲丸中粉防己堿與防己諾林堿的含量[J]. 天津醫(yī)藥, 2007, 35(4): 289.

[16]侯麗麗, 晏永新, 張麗. HPLC法測定復(fù)方防己口服液中粉防己堿和防己諾林堿的含量[J]. 中國獸藥雜志, 2013, 47(2): 24-26.

[17]王秀琴, 呂佳, 趙琳, 等. HPLC法測定風(fēng)痛寧顆粒中粉防己堿含量[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2013, 15(5): 58-59.

Simultaneous determination of tetrandrine in Lixin pills by HPLC

YU Shiting1, ZHAO Daqing1, YIN Yiqiu2, BAI Xueyuan1*
(1. Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China; 2. GeneScience Pharmaceuticals Co., Ltd. Changchun 130117, China)

Objective To establish the method for the determination of tetrandrinein Lixin pills; Methods HPLC method was used. Column: Agilent, ZORBAX SB-Aq (5 μm, 4.6 mm×250 mm); Solution: methanol-acetonitrilewater-diethylamine (60:20:20:0.08). Detection wavelength: 282 nm, temperature:25 ℃, tate: 1.0 mL/min. Results The linear ranges of tetrandrine were 0.309 6～1.857 6 μg (r=0.999 8). The average recoverys were 98.3% (RSD=1.42%). Conclusion The method is simple, specifc, accurate and reliable, which can be used for the quality control of the Lixin pills.

Lixin pill; tetrandrine; Rp-HPLC

R284.2

A

2095-6258(2017)04-0538-03

2016-11-29）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.04.008

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金“利心丸的近紅外光譜質(zhì)量控制方法研究”（2012ZL089）。作者簡介：于士婷（1994 -），女，碩士研究生，主要從事中藥有效成分研究及產(chǎn)品開發(fā)。

*通信作者：白雪媛，醫(yī)學(xué)碩士，副研究員，碩士研究生導(dǎo)師，電話-13596460780，電子信箱- baixy1212@163.com